Summary
Denna video visar ny kultur, en metod som kycklingembryon odlas utanför ägget i upp till 24 tim. Denna metod gör en att studera tidig utveckling (primitivstrimman till 14 SOM.) En period som motsvarar E7-9 i mus. Tillämpningar av denna teknik inkluderar elektroporation, in situ hybridisering och immunhistokemi.
Abstract
Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera bildning och mönstring av hjärnan, neuralrörsdefekter, somit och hjärta primordia. Tillämpningar av kycklingembryo kultur inkluderar elektroporering av DNA eller RNA konstruktioner för att analysera geners funktion, ympar av bestruket tillväxtfaktor pärlor som FGFs och BMP, liksom hela montera in situ hybridisering och immunhistokemi. Denna video visar de olika stegen i kycklingembryo kultur, det första är embryot explanterade i koksaltlösning. Då är embryot centrerad på ett glas ring. Membranen omger embryot lyfts längs väggarna i ringen. Ringen placeras sedan i en kultur maträtt som innehåller en pool av albumine. Kulturen skålen är förseglas och placeras i en fuktig kammare, där embryot odlas i upp till 24 timmar. Slutligen är embryot ut ur ringen, fasta och bearbetas för ytterligare ansökningar. En felsökningsguide presenteras också.
Protocol
Del 1: Bänk upprätta
- En fuktig kammare är beredd genom att placera Kimwipe / DDH 2 O i kammare av plast.
- En Falcon rör för att samla in albumin, rätter för kultur, ringar, klockglas och avfallshantering placeras på bänken.
- Pyrex skålen är fylld med 1,4 liter saltlösning (se not [a]).
Del 2: Embryo är uttagna i saltlösning
- Ägg är ur inkubatorn efter 16 timmar (steg 4). Ägget är opene genom att knacka på skalet med pincett. Shell bitar tas bort.
- Den tunna albumin samlas i Falcon rör. Den tjocka albumin bort med pincett.
- Embryot placeras i en plast skål inuti koksaltlösning skålen. Resterande albumin bort med pincett.
Del 3: Embryot är centrerad på ringen
- Den gulesäcken lutar med pincett så att embryot vänd uppåt.
- Den gulesäcken skärs i nivå med ekvatorn eller lägre.
- Med fin pincett är vitelline membranet snabbt skalade. Den vitelline membranet är orienterad så att dess granulat sida (ej skinande) är vänd uppåt.
- Med fin pincett är vitelline membran placeras på urglas.
- Med fin pincett, ett glas ring tillämpas på toppen av vitelline membran och embryot är centrerad.
- Den vitelline membranet lyfts upp runt kanterna på glaset ringen. Monteringen tas bort från koksaltlösning skålen.
Del 4: Kulturen är inställd under mikroskop
- Den vitelline membranet lyfts över glaset ringen med fin pincett under mikroskop.
- Använda pasteurpipett är saltlösning bort från ytterkanten av ringen.
- Använda fina saxar, är överskott vitelline membranet avlägsnas från den inre kanten av glaset ringen. Man ser till att inte tränga igenom membranet med pipett eller pincett.
- Embryot är försiktigt sköljas med saltlösning för att avlägsna löst membran och celler äggula.
- 200 l koksaltlösning läggs till ytterkanten av ringen (detta kommer att underlätta senare överföring).
- Monteringen är täckt med en inverterad plast skålen.
Del 5: Kulturen överförs till inkubator
- En Falcon kultur maträtt är märkt.
- 2,5 ml av tunna albumin läggs till botten av Falcon skålen.
- 200μl av tunna albumin läggs till den inre kanten av locket på Falcon skålen.
- Den inverterade skålen tas bort från församlingen.
- Med fin pincett, är glaset ringen slided längs kanten av urglas, och överförs till Falcon skålen.
- Alla återstående saltlösning tas bort från insidan av ringen.
- The Falcon skålen är täckt med lock och förseglad.
- Monteringen är placerad i fuktig kammare och sedan i inkubatorn.
- Embryona odlas upp till 24 timmar vid 38 ° C.
Del 6: Efter kultur, är embryot fast, kultur överförs till inkubator
- En fixering skålen är fylld med iskallt PBS (eller DEPC-PBS om embryon skall bearbetas för in situ hybridisering).
- Kulturen tas bort från inkubatorn och omedelbart placeras på is. Kulturen skålen är direkt fylld med iskallt PBS / DEPC-PBS.
- Embryot är avskild från vitelline membranet. Embryot överförs till fixering skålen, med den trubbiga änden av en pasteurpipett.
- Embryot är låst ner med trubbig slutade bra pincett. PBS som täcker fixering skålen tas bort. Fixativ läggs (se not [b]).
- Beroende på tillämpning, är embryot fast för 6-8 tim vid 4 ° C (kryostat), O / N vid 4 ° C (i situs), eller 1 timme vid RT för hela berget immunohistokemi.
- Den fixativ avlägsnas och ersätts med iskall PBS / DEPC PBS.
- För nedströms applikationer såsom in situ hybridisering eller immantibody färgning: nervsystemet och hjärtat är perforerade med ett trubbigt slutet microcapillary nål eller en microdissection kniv, vilket kommer att hindra fångst av sond / antikropp i senare steg.
Anteckningar: [A] Saline består av: lösning A (för 1 l): 121,0 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,4 g CaCl 2 .2 H 2 O, 12,7 g MgCl 2 0,6 H 2 O, lösning B (för 1 l) : 2,4 g Na 2 HPO 4 .2 H 2 O, 0,2 g NaH 2 PO 4 .2 H 2 O, Autoklav, före användning, blanda 120 ml Ett med 2700 ml H 2 O, Tillsätt 180 ml B. Blanda [1]; [b] Fixative är beredd omedelbart före användning (4% PFA i PBS eller DEPC-PBS i situs).
Del 7: representativa resultat
Före kultur, är embryot till primitivstrimman skede (HH4). I slutet av kulturen period har embryot utvecklats till HH10 (längd 2-3 mm) och är synlig i mitten av kulturen skålen. Det är möjligt att märka en grupp celler med carbocyanine fluorescerande DIIprecis innan kultur (0h) och följer deras rörlighet inom kulturen perioden. I detta fall var cellerna under Hensen nod (HN) märkt med DII. Dessa celler är visat sig bidra till att successivt utveckla somites (SOM) och notochord (n). 
Del 8: Felsökning
| Problem | Orsak | Remedy |
|---|---|---|
| Embryo är med äggula stället för att komma iväg med membran (steg 2) | Dålig äggkvalitet | Begär nylagad ägg, Store ägg vid 13 ° C vid mottagandet. Inkubera ägg samma dag som ankomstdatum. |
| Vitelline membranet glida bort från urmakare glas efter placering av ringen (steg 3) | Albumin rester | I steg 2, se till att alla albumin tas bort genom att dra bort från membranet med lutande pincett |
| Embryo är tillgänglig: lögner under membranet (steg 4) | Fel sida av membranet är uppåt | I steg 3, se till att den sida av membranet innehåller äggulan granulat är vänt uppåt. Den blanka, polerade sida ska vara vänd nedåt. |
| Embryo nedsänkt i saltlösning / albumin följande kultur (steg 6) | Saline / albumin kvar i ringen före kultur, hål i membranet | I steg 5, se till att alla albumin / saltlösning tas bort från insidan av ringen, I steg 4, se till att du inte pierca membran med pincett (använd trubbig slutade pincett) |
| Embryo upplöstes efter kultur | Bakteriell infektion | Sterilisera alla verktyg och glasvaror; antibiotika / antimykotika |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nya kulturen metod 2 kan användas för en mängd olika tillämpningar, från transplantat av tillväxtfaktor som innehåller pärlor 3, till hela montera in situ hybridisering och hela montera immunohistokemi 4. Kultur över en 24-timmars period möjliggör kontinuerlig övervakning av embryonal utveckling i applikationer såsom tid förfaller celler rörelseanalys 5 eller övervakning av GFP innehåller electroporated konstruktioner 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
