Summary
هذا الفيديو يوضح ثقافة جديدة ، وهي الطريقة التي يتم تربيتها افراخ الدجاج خارج البويضة لمدة تصل إلى 24 ساعة. هذه الطريقة تمكن واحد لدراسة التطور المبكر (مسحة البدائية إلى 14 سوم) ، وهي الفترة المقابلة ل9 - E7 في الماوس. تطبيقات هذه التقنية تشمل electroporation ، التهجين في الموضع والمناعية.
Abstract
الجنين الفرخ هو أداة قيمة في دراسة التطور الجنيني المبكر. شفافيته ، وسهولة الوصول وسهولة التلاعب ، وجعلها أداة مثالية لدراسة تشكيل والزخرفة من والدماغ الجسيدة ، الأنبوب العصبي والقلب primordia. تطبيقات الثقافة الجنين الفرخ تشمل electroporation بنيات الحمض النووي الريبي أو من أجل تحليل وظائف الجينات ، والطعوم من الخرز عامل النمو المغلفة مثل FGFs وأفضل الممارسات الإدارية ، وكذلك جبل بأكمله في الموقع التهجين والمناعية. هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في الثقافة الجنين فرخ ؛ أولا ، explanted الجنين في المياه المالحة. ثم ، يتركز على الجنين حلقة الزجاج. يتم رفع الأغشية التي تحيط بالجنين على طول الجدران من الحلبة. ثم يتم وضع الخاتم في صحن الثقافة التي تحتوي على مجموعة من albumine. غير مختومة طبق الثقافة وضعت في غرفة رطبة ، حيث يتم تربيتها في جنين لمدة تصل إلى 24 ساعة. أخيرا ، تتم إزالة الجنين من الحلقة ، والثابتة وتجهيزها لتطبيقات أخرى. وتقدم أيضا دليلا المشاكل.
Protocol
الجزء 1 : بينش إعداد
- ويتم إعداد الغرفة الرطبة عن طريق وضع Kimwipe / 2 O DDH في غرفة البلاستيك.
- يتم وضع أنبوب فالكون لجمع الزلال ، والأطباق للثقافة والخواتم وwatchglass والتخلص من النفايات على مقاعد البدلاء.
- يمتلئ صحن بيركس مع المالحة ل 1.4 (انظر الملاحظات [أ]).
جزء 2 : explanted الأجنة في المياه المالحة
- تتم إزالة البيض من الحاضنة بعد 16 ساعة (المرحلة 4). البيض هو opene بالنقر على قذيفة بالملقط. تتم إزالة القطع قذيفة.
- يتم جمع الزلال في أنبوب رفيع من طراز فالكون. تتم إزالة ألبومين سميك بالملقط.
- يتم وضع الجنين في طبق من البلاستيك داخل صحن المالحة. يتم إزالة ما تبقى الألبومين بالملقط.
الجزء 3 : يتركز على عصابة الأجنة
- إمالة كيس المح مع ملقط الجنين بحيث يواجه صعودا.
- يتم قطع الكيس المحي على مستوى خط الاستواء أو أقل.
- باستخدام الملقط غرامة ، وبسرعة غير مقشر الغشاء المحي. توجه الغشاء المحي بحيث جانبها الحبيبية (تسلق غير) تواجه صعودا.
- باستخدام الملقط غرامة ، ويتم وضع الغشاء المحي على الزجاج ووتش.
- باستخدام الملقط غرامة ، ويتم تطبيق حلقة الزجاج على رأس الغشاء المحي ويتركز الجنين.
- رفع الغشاء المحي حول حواف الزجاج الدائري. تتم إزالة التجميع من الطبق المالحة.
الجزء 4 : يتم تعيين الثقافة تحت المجهر
- رفع الغشاء المحي على الحلبة الزجاج باستخدام الملقط غرامة تحت المجهر.
- باستخدام ماصة باستور ، تتم إزالة الملوحة من الحافة الخارجية للحلقة.
- باستخدام مقص غرامة ، ويتم إزالة الزائدة الغشاء المحي من الحافة الداخلية للحلقة الزجاج. هو الحرص على عدم اختراق الغشاء مع ماصة أو ملقط.
- يتم شطف بلطف الجنين مع المياه المالحة لإزالة أغشية الخلايا فضفاضة وصفار البيض.
- يضاف 200 ميكرولتر المالحة إلى الحافة الخارجية للحلقة (وهذا سيسهل نقل في وقت لاحق).
- تتناول التجميع مع طبق من البلاستيك مقلوب.
الجزء (5) : يتم نقل الثقافة إلى الحاضنة
- هو المسمى طبق الثقافة فالكون.
- يضاف 2.5ml رقيقة من الزلال في قاع الطبق فالكون.
- يضاف 200μl رقيقة من الزلال إلى الحافة الداخلية للغطاء الطبق فالكون.
- تتم إزالة طبق مقلوب من التجمع.
- باستخدام الملقط الجميلة ، هو حلقة slided الزجاج على طول حافة الزجاج ووتش ، ونقل إلى طبق من طراز فالكون.
- تتم إزالة كافة المالحة المتبقية من السطح الداخلي للحلقة.
- تتناول الطبق فالكون مع غطاء ومختومة.
- وضعت الجمعية العامة في الغرفة الرطبة ثم في الحاضنة.
- تستزرع الأجنة لمدة تصل إلى 24 ساعة على 38 درجة مئوية.
الجزء 6 : ثقافة التالية ، يتم إصلاح الجنين ؛ يتم نقل الثقافة إلى الحاضنة
- يملأ طبق التثبيت مع الثلج الباردة PBS (أو depc PBS لو الأجنة التي سيتم تجهيزها لفي الموقع التهجين).
- تتم إزالة الثقافة من الحاضنة وضعه على الفور على الجليد. يتم تعبئة الطبق فورا مع ثقافة الجليد الباردة PBS / depc PBS.
- يتم فصل الجنين من الغشاء المحي. يتم نقل الجنين الى صحن التثبيت ، وذلك باستخدام لفظة نهاية ماصة باستور.
- ويعلق الجنين أسفل باستخدام الملقط حادة العضوية الغرامة. تتم إزالة برنامج تلفزيوني تغطي الطبق التثبيت. يضاف تثبيتي (انظر الملاحظات [ب]).
- اعتمادا على التطبيق ، ويتم إصلاح الجنين لمدة 6-8 ساعة على 4 درجات مئوية (ناظم البرد) ، O / N عند 4 درجات مئوية (في مكان المال) ، أو 1 ساعة على RT لالمناعية جبل بأكمله.
- تتم إزالة تثبيتي ، والاستعاضة عنها الجليد الباردة PBS / PBS depc.
- لتطبيقات المصب مثل التهجين في الموضع أو تلطيخ immantibody : الجهاز العصبي والقلب ومثقبة باستخدام إبرة حادة نهاية microcapillary أو سكين microdissection ، وهذا سوف يمنع من محاصرة المسبار / الضد في خطوات لاحقة.
ملاحظات : [أ] المؤسسة العامة لتحلية تتكون من : الحل (لل1 لتر) : 121.0 غرام كلوريد الصوديوم ، و 15.5 غرام بوكل ، 10.4 ز 0.2 CaCl 2 H 2 O ، 12.7 ز 0.6 MgCl 2 H 2 O ، B الحل (لل1 لتر) : 2.4 ز نا 2 4 هبو 0.2 H 2 O ، 0.2 غ ناه 2 PO 4 H 2 O 0.2 ؛ الأوتوكلاف ؛ قبل استخدامها ، والمزيج مع 120 مل 2700 مل O 2 H ؛ إضافة 180 مل B. ميكس [1] ؛ [ب] مستعدة تثبيتي فقط قبل استخدام (4 ٪ PFA في برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني من أجل depc في موقع المال).
الجزء 7 : النتائج الممثل
قبل الثقافة ، والجنين في مرحلة بدائية متتالية (HH4). في نهاية الفترة والثقافة ، وقد وضعت الجنين الى HH10 (طول 2-3 مم) ومرئيا في وسط الطبق الثقافة. فمن الممكن لتسمية مجموعة من الخلايا مع carbocyanine الجاذبة الفلورسنتقبل الثقافة (0h) ، ومتابعة حركتهم طوال فترة الثقافة. في هذه الحالة ، وصفت الخلايا أدناه عقدة هنسن (HN) مع صلاح الغيدان. وتظهر هذه الخلايا إلى المساهمة في تطوير somites تدريجيا (سوم) وnotochord (ن). 
الجزء 8 : استكشاف
| مشكلة | سبب | علاج |
|---|---|---|
| الجنين لا يزال مع صفار البيض بدلا من نزوله مع غشاء (الخطوة 2) | سوء نوعية البيض | طلب إنتاج البيض الطازج والبيض مخزن عند 13 درجة مئوية عند وروده. احتضان البيض في نفس اليوم كتاريخ وصولهم. |
| الغشاء المحي الشريحة بعيدا عن ساعاتي زجاج التنسيب للحلقة التالية (الخطوة 3) | بقايا الزلال | في الخطوة 2 ، تأكد من أن تتم إزالة كافة الألبومين عن طريق سحبها بعيدا عن غشاء ملقط مع إمالة |
| الجنين لا يمكن الوصول إليه : تقع تحت الغشاء (الخطوة 4) | الجانب الخاطئ من الغشاء هو صعودا | في الخطوة 3 ، تأكد من جانب تحتوي على حبيبات الغشاء صفار تواجه صعودا. يجب أن لامعة ، والجانب المصقول تواجه هبوطا. |
| جنين الغارقة في ثقافة التالية المالحة / الزلال (الخطوة 6) | المالحة / الزلال اليسار داخل الحلبة قبل الثقافة ؛ ثقب في غشاء | في الخطوة 5 ، تأكد من أن تتم إزالة كافة الزلال / المالحة من داخل الحلبة ، في الخطوة 4 ، تأكد من أنك لا يخترق غشاء بالملقط (استخدام الملقط حادة انتهت) |
| تفككت الجنين ثقافة التالية | العدوى البكتيرية | تعقيم جميع الأدوات والأواني الزجاجية ، واستخدام المضادات الحيوية / مضاد فطري |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام أسلوب 2 للثقافة الجديدة تشكيلة واسعة من التطبيقات ، بدءا من الطعوم من عامل النمو التي تحتوي على حبات 3 ، لتحميل كامل التهجين في الموقع وتحميل كامل المناعية 4. الثقافة خلال فترة 24 ساعة تمكن الرصد المستمر من التطور الجنيني في تطبيقات مثل الفاصل الزمني خلية تحليل حركة 5 أو رصد GFP تحتوي على ثوابت electroporated 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة مارغريت Alkek M. إلى RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
