Summary
Este vídeo demonstra nova cultura, um método pelo qual embriões de galinha são cultivadas fora do ovo por até 24 horas. Este método permite o estudo do desenvolvimento inicial (linha primitiva para 14 som.), Um período correspondente ao E7-9 no mouse. Aplicações desta técnica incluem eletroporação, hibridização in situ e imunohistoquímica.
Abstract
O embrião de galinha é uma ferramenta valiosa no estudo do desenvolvimento embrionário precoce. Sua transparência, acessibilidade e facilidade de manipulação, torná-lo uma ferramenta ideal para estudar a formação e padronização do cérebro, tubo neural somito, e primórdios do coração. Aplicações da cultura de embriões de pintos incluem eletroporação de construções de DNA ou RNA, a fim de analisar a função do gene, os enxertos de contas do fator de crescimento revestido como FGFs e BMPs, bem como montar toda a hibridização in situ e imunohistoquímica. Este vídeo demonstra as diferentes etapas na cultura embrião de galinha; Primeiro, o embrião é explantes em solução salina. Então, o embrião é centrada em um anel de vidro. Membranas que envolvem o embrião são levantadas ao longo das paredes do anel. O anel é então colocada em um prato de cultura contendo um pool de albumina. O prato cultura é lacrado e colocado em uma câmara úmida, onde o embrião é cultivado por até 24 hrs. Finalmente, o embrião é removido do anel, fixadas e processadas para outras aplicações. Um guia resolução de problemas também é apresentada.
Protocol
Parte 1: Banco configurar
- A câmara úmida é preparado colocando Kimwipe / DDH 2 O na câmara de plástico.
- Um tubo de Falcon para coletar albumina, pratos para a cultura, anéis, vidro de relógio e eliminação de resíduos são colocados no banco.
- Pirex é preenchido com solução salina 1,4 l (ver notas [a]).
Parte 2: Embrião é explantes em solução salina
- Os ovos são retirados da incubadora após 16 horas (estágio 4). O ovo é opene tocando no shell com uma pinça. Shell peças são removidas.
- A albumina fina é coletado em tubo de Falcon. A albumina espessa é retirado com uma pinça.
- O embrião é colocado em um prato de plástico dentro do prato salina. A albumina restante é retirado com uma pinça.
Parte 3: Embrião é centrada no anel
- O saco vitelino é inclinado com uma pinça, para que embrião voltado para cima.
- O saco vitelino é cortado ao nível do equador ou abaixo.
- Utilizando uma pinça fina, a membrana vitelina é rapidamente descascados. A membrana vitelina é orientado de forma que seu lado granular (shinny não) virado para cima.
- Utilizando uma pinça fina, a membrana vitelina é colocado no vidro de relógio.
- Utilizando uma pinça fina, um anel de vidro é aplicado em cima da membrana vitelina e embrião é centralizado.
- A membrana vitelina é levantada em torno das bordas do anel de vidro. O conjunto é removido do prato salina.
Parte 4: A cultura está configurado sob microscópio
- A membrana vitelina é levantada sobre o anel de vidro usando uma pinça fina ao microscópio.
- Usando uma pipeta Pasteur, a solução salina é removido da borda externa do anel.
- Com uma tesoura fina, membrana vitelina excesso é removido a partir da borda interna do anel de vidro. Cuidado é tomado para não perfurar a membrana com pipeta ou fórceps.
- O embrião é gentilmente lavada com solução salina para remover membranas e células soltas gema.
- 200 mL solução salina é adicionada à borda externa do anel (o que facilitará depois de transferência).
- O conjunto é coberto com um prato de plástico invertido.
Parte 5: A cultura é transferido para incubadora
- A placa de cultura Falcon é rotulado.
- 2,5 ml de albumina fina é adicionado ao fundo do prato Falcon.
- 200μl de albumina fina é adicionado à borda interna da tampa do prato Falcon.
- O prato invertido é retirado da montagem.
- Utilizando uma pinça fina, o anel de vidro é slided ao longo da borda do vidro de relógio, e transferido para o prato Falcon.
- Todos os salina restante é removido da superfície interna do anel.
- O prato Falcon é coberta com tampa e selada.
- O conjunto é colocado em câmara úmida e, em seguida, na incubadora.
- Os embriões são cultivados por até 24 horas a 38 ° C.
Parte 6: Após a cultura, o embrião é fixo, a cultura é transferido para incubadora
- Um prato cheio de fixação é gelada PBS (PBS ou DEPC-se os embriões devem ser tratados para hibridização in situ).
- A cultura é removida da incubadora e imediatamente colocado no gelo. A placa de cultura é imediatamente preenchida com gelado PBS / DEPC-PBS.
- O embrião é separado da membrana vitelina. O embrião é transferido para o prato de fixação, utilizando-se o fim brusco de uma pipeta Pasteur.
- O embrião é preso usando ponta e uma pinça fina. A PBS cobrindo o prato de fixação seja removido. Fixador é adicionado (ver notas [b]).
- Dependendo da aplicação, o embrião é fixada por 6-8 horas a 4 ° C (criostato), S / N, 4 ° C (em situs), ou 1 hora em temperatura ambiente por imuno-histoquímica montar todo.
- O fixador é removido e substituído com gelado PBS / PBS DEPC.
- Para aplicações a jusante, como a hibridização in situ ou coloração immantibody: o sistema nervoso eo coração são perfurados com uma agulha de ponta romba microcapilar ou uma faca microdissecção, o que irá evitar aprisionamento de sonda / anticorpo em etapas posteriores.
Notas: [a] Saline consiste em: Uma solução (para 1 l): 121,0 g NaCl, KCl 15,5 g, 10,4 g CaCl 2 .2 H 2 O, 12,7 g MgCl 2 .6 H 2 O; solução B (para 1 l) : 2,4 g Na 2 HPO 4 .2 H 2 O, 0,2 g NaH 2 PO 4 .2 H 2 O; Autoclave; Antes de usar, misturar 120 ml A com 2700 ml H 2 O; Adicione 180 ml B. Mix [1]; [b] Fixação é preparado imediatamente antes de usar (PFA 4% em PBS ou DEPC-PBS no situs).
Parte 7: Resultados Representante
Antes da cultura, o embrião está no estágio linha primitiva (HH4). No final do período de cultivo, o embrião tem desenvolvido para HH10 (comprimento 2-3 mm) e é visível no centro do prato cultura. É possível rotular um grupo de células com carbocyanine DII fluorescentespouco antes de cultura (0h) e seguir o seu movimento durante o período de cultura. Neste caso, as células abaixo do nó de Hensen (HN) foram marcados com DII. Estas células são mostrados para contribuir para somitos progressivamente em desenvolvimento (som) e notocorda (n).
Parte 8: Resolução de problemas
Problema | Causa | Remédio |
---|---|---|
Embrião permanece com a gema em vez de vir fora com membrana (etapa 2) | A má qualidade do ovo | Pedido recém-produzido os ovos, ovos de loja a 13 ° C após o recebimento. Incubar os ovos no mesmo dia como data de chegada. |
Vitelínico deslize membrana longe de seguir relojoeiro vidro colocação de anel (passo 3) | Restos de albumina | No passo 2, certifique-se que todos os albumina é removido puxando-o longe de membrana com uma pinça inclinado |
Embrião é inacessível: encontra-se abaixo da membrana (passo 4) | Lado errado da membrana é para cima | No passo 3, verifique se o lado da membrana que contêm grânulos da gema é voltado para cima. O lado brilhante, polido deve ficar voltada para baixo. |
Embrião submerso em soro fisiológico / albumina cultura seguinte (passo 6) | Furo na membrana; soro fisiológico / albumina deixados no interior do anel antes da cultura | No passo 5, certifique-se que todos os albumina / salina é removido de dentro do anel; Na etapa 4, verifique se você não furar membrana com uma pinça (utilize uma pinça blunt terminou) |
Embrião se desintegrou após a cultura | Infecção bacteriana | Esterilizar todos os instrumentos e suas obras, uso de antibiótico / antimicótico |
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Discussion
O método de cultura de Nova 2 pode ser usado para uma ampla variedade de aplicações, que vão desde enxertos do fator de crescimento contendo grânulos 3, para montar toda a hibridização in situ e imunohistoquímica montar todo 4. Cultura ao longo de um período de 24 horas permite o acompanhamento contínuo do desenvolvimento embrionário em aplicações como o tempo de análise do movimento lapso célula 5 ou monitoramento de GFP contendo construções electroporated 6.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela M. Margaret Alkek Fundação RHF.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
Pyrex dish (2) | Tool | |||
Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).