Summary
Это видео демонстрирует, 2-цветный целом монтировать на месте гибридизация, метод, которым пространственной и временной экспрессии в 2 разные гены могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Дэвид Уилкинсон, Домингос Энрике, Фил Ингам и Дэвид Иш-Horowicz.
Abstract
Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для изучения экспрессии генов в мозге, нервной трубки, сомитов и формирование зачатков сердца. Это видео демонстрирует различные этапы в 2-х цветный целом монтировать на месте гибридизации; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эмбрион обрабатывается для prehybridization. Эмбрион, то гибридизированных с двумя различными датчиками, один связан с DIG, а один связан с FITC. После ночи гибридизации, эмбрион инкубировали с антителами DIG связаны. Цветная реакция на подложке DIG выполняется, и область интереса появляется синий. Эмбрион затем инкубировали с FITC связанных антител. Эмбриона обрабатывается для цветной реакции с FITC, и область интереса появляется красное. Наконец, эмбрион является фиксированной и обработаны для phtograph и секционирования. Руководство по устранению неисправностей также представлен.
Protocol
Часть 1: Крепление эмбрионов
- Заполните рассечение блюдо с ледяной DEPC-би-эс. Держите на льду. Открытое яйца, нажав оболочки щипцами и удалить оболочку штук.
- Удалить толстые альбумина щипцами. Tilt желточного мешка с грубыми щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
- Использование ножницы, разрезать квадрат желточного мешка вокруг эмбриона.
- Использование ложкой, удалить эмбрион с желтком и поставьте на лед холодной DEPC-би-эс.
- Под микроскопом, удалите мембраны и желток и трансфер в фиксации блюдо.
- Pin вниз, удалить DEPC-би-эс. Заменить на 4% PFA в DEPC-би-эс и исправить O / N при 4 ° C.
- Удалить фиксатором. Замените ледяной DEPC-би-эс. Использование тупым концом иглы или микрокапиллярных микродиссекции нож, перфорировать нервной системы и полостей сердца, чтобы предотвратить захват зонда.
- Вымойте 2x 10 млн. DEPC-PBS с 0,1% Твин-20 (PBT). Дегидрировать 10 млн. каждый на 25%, 50%, 75% метанола в PBT. Дегидрировать эмбрионов два раза в 100% метанола. Хранить при температуре от -20 ° C в метаноле.
Часть 2: Prehybridization
- Увлажняет эмбрионов 10 млн. каждый на 75%, 50% и 25% метанола в PBT. Вымойте 2x 10 млн. в PBT.
- Между тем, готовить ледяной фиксатор (4% параформальдегида в PBT). Замените PBT с протеиназы К решению (3 мл / флакон; [? 5 г / мл] финала в PBT). Убедитесь, что весь флакон подвергается решение протеиназы К, осторожно вращая флакон, см. Поиск и устранение неисправностей для экспозиции.
- Использование РНКазы свободной пипетки Пастера удалить протеиназы К и добавить фиксатор (2 мл). Сразу же место на льду ровно 20 млн.
- Все РТ моет выполняются на nutator. Вымойте 2x 10 млн. в PBT, и 1x 10mn в PBT, содержащей 50% гибридизации буфера.
- Вымойте 1x в гибридизации буфера. Инкубировать при 65 ° С в 2 мл буфера для гибридизации 4-5 часов.
Часть 3: гибридизации эмбрионов с зондами
- DIG и FITC связанных зонд синтез описан в Приложении. Зонд должны дать сильный сигнал, должно быть synhesized с FITC-содержащих нуклеотидов; слабее зонд должен быть синтезирован с с DIG-содержащих нуклеотидов.
- Prewarm зондов при гибридизации буфер (500 нг / мл) с использованием 2 мл флакон. Незамедлительно заменить гибридизации буфер с зондом решение. Не позволяйте эмбрионов сухой. Инкубируйте в течение 16 ч при 65 ° C.
- Замените датчик с гибридизации буфер, 2 мойки, 30 млн. каждый при температуре 65 ° C. Вымойте 15 млн. в буфере гибридизации / MABT (1 / 1 о / о /) при 65 ° C.
Часть 4: DIG инкубации антитела и цветной реакции
- Вымойте 2x20 млн. в MABT. Промыть 1 час в 2% BBR / MABT. Вымойте 5 часов в 2% BBR/20% HISS / MABT (блокирующего буфера). Инкубируйте в 1:2000 DIG антител разводят в блокирующем буфере, O / N при температуре 4 ° С на nutator.
- Вымойте 3x 10 млн каждый в MABT, и 3-кратным 1 час каждый в MABT.
- Вымойте 2x 20 млн. в NTMT. Добавить 200ul НБТ / BCIP подложки до 10 мл NTMT. Немедленно удалите из флакона NTMT и заменить 1-2 мл НБТ / BCIP буфера. Место в темноте. Монитор цветной реакции после 20 млн, а на 20 млн интервалами в дальнейшем.
- После цветной реакции (должен появиться синий), умойся в PBS в течение 10 мин, придавить на фиксацию блюдо заполнено PBS, и заменить решение с 4% PFA в PBS. Fix O / N при 4 ° C.
- Переезд в новый флакон сцинтилляции. Стирать в PBST (PBS с 1% Твин-20) 2х10 мин. Стирать в MABT 2x 10 мин.
- Инкубируйте в MABT 30 млн. на 63 ° C.
Часть 5: FITC инкубации антитела и цветной реакции
- Вымойте 2x 10 млн. в MABT, 1 час в 2% BBR / MABT, 5 часов в блокирующем буфере
- Инкубируйте в щелочной фосфатазы связью анти-FITC-антител (1:500) O / N при 4 ° C.
- Вымойте 3x 10 млн каждый в MABT, и 3-кратным 1 час каждый в MABT.
- Стирать в 2x 20 млн. в TBS рН 8,45 с 0,1% Твин-20 (TBST).
- Подготовка векторного Красной рабочего раствора (5 мл) в TBST с использованием реагентов 1,2 и 3 представлены в комплекте. Немедленно удалите из флакона TBST и заменить с буфером Векторный Red. Место в темноте. Монитор цветной реакции после 40 млн., а на 30 млн интервалами в дальнейшем.
- После цветной реакции (должны появиться красные), трансфер эмбрионов PBS.
Часть 6: фиксации и обработки
- Трансфер в фиксации блюдо с PBS, и исправить в 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре или O / N при 4 ° C.
- Стирать в PBS, 2x 10 мин. Для обработки для фотографии, трансфер в 20% глицерина в PBS (это сделает эмбрионов полупрозрачные). Чтобы создать камеру, вырезать 2 полоски ленты ПВХ, наложить их на слайде. Сокращение площади в центре с помощью ножа. Снять квадратные использованием щипцов.
- Чтобы обработать воском для секционирования, трансфер обратно в PBS, мыть 2x 10 млн., обезвоживают в градуированных серии метанола (25%, 50%, 75% и 100% в ФСБ, 10 млн каждый).
- Замените пропанол, 3mn. Замените 1,2,3,4-тетрагидронафталина, 20 млн. следуют Histoclear (2x 1 час). Замените histoclear / воск 1 / 1 (об / об) 60 ° С в течение 1 часа. Замените воском процесспо гистологии.
Часть 7: Решения
Гибридизация буфер, хранят при температуре -20 ° С в Сокол, 50 мл: 25 мл формамида; 3,25 мл (20xSSC), 0,5 мл (0,5 М ЭДТА), 1 мл (10% Твин-20); 2,5 мл (1% SDS) ; 125 UL (20mg/ml тРНК);. 100 мкл (50 мг / мл гепарина) MABT, подготовить 100mM малеиновой кислоты, рН до 7,5 NaOH гранул. Добавить 150 мМ NaCl и 0,1% Твин-20.
NTMT (сделанные непосредственно перед использованием), 50 мл: 1 мл (5М NaCl), 2,5 мл (2 М Трис-HCl pH9.5); 1,25 мл (2M MgCl 2), 5 мл (10% Твин-20).
TBST: 0,1 М Трис-HCl, 0,15 М NaCl, рН 8,45, 0,1% Твин-20.
Часть 8: Поиск и устранение неисправностей
| Проблема | Вызывать | Средство |
|---|---|---|
| Эмбриона, свернувшись калачиком | Недостаточное дегидратации / регидратации | Поддерживать 10 млн. промежутки времени в течение последовательных дегидратации / регидратации шаги |
| Существует нет сигнала датчика | Зонд деградированных загрязнения РНКазы во флаконе | Выполнить зонда на 1% агарозном геле Убедитесь, что весь флакон подвергается решение протеиназы К в шаге 2 |
| Зонд этикетки полостей сердца нервной трубки | Зонд в ловушке | В шаге 2, чтобы убедиться, что все полости перфорированы использованием микродиссекции ножом или микрокапиллярных |
| Эмбрион распался следующие гибридизации (шаг 3) | Протеиназы К шаг влево слишком долго Гибридизация слишком высокая температура | Протеиназы К не следует оставлять более 1 миллиона (стадии 3 + и 4), 2 млн. (этап 5 до 7), 3 млн (стадия 8-10), 4 млн (стадии 11-13) Не гибридизации при Т о высших чем на 65 ° С |
Часть 9: Представитель Результаты
Представитель эмбрионов приведены ниже: (А) Эмбрион (стадия HH7) помечена DIG-Сокс зонд (синий) и FITC-дельта-1 зонда (красный). (B) Эмбрион (стадия HH8) помечена DIG-Pax6 зонд (синий) и FITC-Тсс зонд (красный). Nf, нейронные раза, ANP, передней нервной пластинки, PSM, presomitic мезодермы, п, хорды, NT, нервной трубки). Зонд подарки от лаборатории д-ра. С. Табин, М. Гулдинг, Д. Энрике, Дж. Бриско. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
2-цветная целом монтировать на месте методом гибридизации используется для определения пространственных и временных закономерностей изменения экспрессии генов, с помощью одного или двух генов, представляющих интерес. Приложения включают в себя оценку генной экспрессии новых генов (например, 1,2, а также изменения в экспрессии генов следующим оскорбление (эмбриональных манипуляций 3, бусины 4 и электропорации РНК или ДНК-конструкции 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
