Summary
Cette vidéo montre deux couleurs monter toute l'hybridation in situ, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle des deux gènes différents peuvent être visualisées dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil et David Ingham Ish-Horowicz.
Abstract
L'embryon de poulet est un outil précieux dans l'étude du développement embryonnaire précoce. Sa transparence, l'accessibilité et la facilité de manipulation, en font un outil idéal pour étudier l'expression des gènes dans le cerveau, le tube neural, et le cœur somite primordia formation. Cette vidéo montre les différentes étapes de 2-couleurs monter toute l'hybridation in situ; d'abord, l'embryon est disséquée de l'oeuf et fixés dans du paraformaldéhyde. Deuxièmement, l'embryon est traité pour préhybridation. L'embryon est ensuite hybridée avec deux sondes différentes, l'un couplé à creuser, et un couplé au FITC. Après hybridation pendant la nuit, l'embryon est incubée avec DIG couplé anticorps. Réaction colorée pour le substrat DIG est effectuée, et la région d'intérêt apparaît en bleu. L'embryon est ensuite incubée avec l'anticorps couplé au FITC. L'embryon est traitée pour une réaction de couleur avec le FITC, et la région d'intérêt apparaît en rouge. Enfin, l'embryon est fixe et traitées pour phtograph et le sectionnement. Un guide de dépannage est également présentée.
Protocol
Partie 1: Fixation des embryons
- Remplissez-vaisselle dissection avec de la glace froide DEPC PBS. Restez sur la glace. Ouvrez l'œuf en tapant la coquille avec une pince et retirez les morceaux de coquille.
- Retirer épaisse d'albumine avec une pince. Inclinez le sac vitellin avec une pince afin que les embryons grossière tournée vers le haut.
- Avec des ciseaux, couper un carré de vitellus autour de l'embryon.
- Aide d'une cuillère, retirer l'embryon du jaune d'œuf et le placer sur la glace froide DEPC PBS.
- Sous le microscope, enlever les membranes et le jaune et le transfert à plat de fixation.
- Pin, d'enlever DEPC PBS. Remplacez-le par 4% de PFA dans DEPC-PBS et fixer O / N à 4 ° C.
- Retirer fixateur. Remplacez-la par de la glace froide DEPC PBS. En utilisant une aiguille extrémité émoussée microcapillaire ou un couteau de microdissection, perforer le système nerveux et les cavités du cœur, pour empêcher le piégeage de la sonde.
- Laver 2x 10 mn DEPC PBS avec 0,1% de Tween-20 (PBT). Déshydrater à 10 mn chacun à 25%, 50%, méthanol 75% en PBT. Déshydrater embryons à deux reprises dans le méthanol à 100%. Conserver à -20 ° C dans le méthanol.
Partie 2: Préhybridation
- Réhydrater embryons à 10 mn chacun à 75%, 50% et 25% de méthanol dans le PBT. Laver 2x 10 mn en PBT.
- Pendant ce temps, préparer la glace froide fixateur (paraformaldéhyde 4% en PBT). Remplacer PBT avec la protéinase K solution (3 ml / flacon; [? 5 g / ml final] en PBT). Assurez-vous que le flacon entier est exposé à la protéinase K solution en faisant rouler délicatement le flacon, voir Dépannage des durées d'exposition.
- Utiliser RNase Pasteur pipette pour enlever la protéinase K et ajouter fixateur (2 ml). Immédiatement placer sur la glace pendant exactement 20 mn.
- Tous les lavages sont effectués sur RT nutator. Laver 2x 10 mn en PBT, et 1x 10mn en PBT contenant le tampon d'hybridation de 50%.
- Lavez 1x dans le tampon d'hybridation. Incuber à 65 ° C en 2 ml de tampon d'hybridation pour 4-5 heures.
Partie 3: les embryons hybrides avec des sondes
- DIG et la synthèse de sonde couplée au FITC est décrite dans l'annexe. La sonde devrait donner un signal fort, doit être synhesized avec FITC contenant les nucléotides, la plus faible de la sonde doit être synthétisés avec des DIG contenant les nucléotides.
- Préchauffer sondes dans le tampon d'hybridation (500 ng / ml chacune) en utilisant un flacon de 2 ml. Rapidement remplacer le tampon d'hybridation avec la solution de sonde. Ne laissez pas les embryons sec. Incuber pendant 16 heures à 65 ° C.
- Remplacer la sonde avec un tampon d'hybridation, 2 lavages, 30 mn chacun à 65 ° C. Laver à 15 mn dans le tampon d'hybridation / MABT (1 / 1 v / v /) à 65 ° C.
Partie 4: incubation d'anticorps DIG et la couleur de réaction
- Lavez 2x20 mn en MABT. Lavez 1 h à 2% BBR / MABT. Laver 5 h à 2% BBR/20% HISS / MABT (tampon de blocage). Incuber dans 1:2000 DIG anticorps dilué dans un tampon de blocage, O / N à 4 ° C sur nutator.
- Laver 3x 10 mn chacun dans MABT, et 3x 1 heure chacune dans MABT.
- Laver 2x 20 mn dans NTMT. Ajouter 200ul substrat NBT / BCIP à 10 NTMT ml. Retirer immédiatement NTMT du flacon et de le remplacer par 1-2 ml de NBT / BCIP tampon. Placer dans l'obscurité. Moniteur réaction colorée après 20 mn, et à intervalles 20 mn après.
- Suite à la réaction de couleur (bleu devrait apparaître), se laver dans du PBS pendant 10 mn, épingler sur le plat de fixation remplis avec du PBS, et remplacer la solution à 4% en PBS PFA. Fix O / N à 4 ° C.
- Transfert à nouveau flacon à scintillation. Laver dans du PBST (PBS avec 1% de Tween-20) 2x10 mn. Laver à l'MABT 2x 10 mn.
- Incuber dans MABT 30 mn à 63 ° C.
Partie 5: l'incubation d'anticorps FITC et la couleur de réaction
- Laver 2x 10 mn dans MABT, 1 h à 2% BBR / MABT, 5 h en tampon de blocage
- Incuber dans la phosphatase alcaline couplée anti-FITC-anticorps (1:500) O / N à 4 ° C.
- Laver 3x 10 mn chacun dans MABT, et 3x 1 heure chacune dans MABT.
- Laver à 2x 20 mn dans du TBS pH 8,45 avec 0,1% de Tween-20 (TBST).
- Préparer Vecteur Rouge solution de travail (5 ml) dans TBST utilisant les réactifs 1,2 et 3 fournis dans le kit. Retirer immédiatement TBST du flacon et de le remplacer par Vector Rouge tampon. Placer dans l'obscurité. Moniteur réaction colorée après 40 mn, et à intervalles de 30 mn après.
- Suite à la réaction de couleur (rouge devrait apparaître), les embryons transfert à PBS.
Partie 6: Fixation et de traitement
- Transférer dans le plat de fixation contenant du PBS, et de fixer à 4% PFA pour 20 mn à température ambiante ou O / N à 4 ° C.
- Laver dans du PBS, 2x 10 mn. Pour traiter de la photographie, le transfert à 20% de glycérol dans du PBS (cela rendra les embryons translucide). Pour créer une chambre, couper deux bandes de ruban en PVC, les superposer sur la diapositive. Couper un carré dans le centre à l'aide d'une lame. Retirer les pinces carré à l'aide.
- Pour traiter de la cire pour la coupe, retour à PBS, laver 2x 10 mn, déshydrater en série graduée de méthanol (25%, 50%, 75% et 100% dans le PBS, à 10 mn chacun).
- Remplacez-le par le propanol, 3mn. Remplacez-le par 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène, à 20 mn suivi d'Histoclear (2x 1 h). Remplacez-le par histoclear / cire 1 / 1 (v / v) 60 ° C pendant 1 heure. Remplacer avec de la cire d'un processuspour l'histologie.
Partie 7: Solutions
Tampon d'hybridation, de stocker à -20 ° C à Falcon de 50 ml: 25 ml de formamide; 3,25 ml (20xSSC); 0,5 ml (0,5 M EDTA); 1 ml (10% de Tween-20); 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml ARNt);. 100ul (50 mg / ml d'héparine) MABT, préparer 100 mM d'acide maléique; pH à 7,5 avec des pastilles de NaOH. Ajouter 150 mM NaCl et 0,1% de Tween-20.
NTMT (faite juste avant l'utilisation), 50 ml: 1 ml (NaCl 5M); 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5); 1,25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (10% de Tween-20).
TBST: Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 8,45, 0,1% Tween-20.
Partie 8: Dépannage
| Problème | Cause | Remède |
|---|---|---|
| Embryons est recroquevillé | Déshydratation insuffisant / réhydratation | Maintenir des intervalles de 10 mn au cours successifs déshydratation / réhydratation étapes |
| Il n'ya pas de signal de la sonde | Probe est dégradé la contamination de RNase en flacon | Exécuter sonde sur agarose à 1% de gel Assurez-vous que le flacon entier est exposé à la protéinase K solution dans l'étape 2 |
| Probe est cavités étiquettes du cœur d'un tube neural | Sonde est piégé | Dans l'étape 2, assurez-vous que toutes les cavités sont perforés couteau microdissection utilisant ou microcapillaire |
| Embryon désintégré hybridation suivante (étape 3) | Protéinase K PG température d'hybridation trop longtemps est trop élevé | Protéinase K ne doit pas être laissé plus longtemps que 1mn (stades 3 et 4 +), à 2 mn (étape 5 à 7), 3 mn (stade 8-10), 4 mn (stade 11-13) ne s'hybrident pas à T o supérieur de 65 o C |
Partie 9: Résultats Représentant
Embryons représentatifs sont présentés ci-dessous: (A) Embryon (stade HH7) est étiqueté avec une sonde DIG-Sox (bleu) et un FITC-delta-1 sonde (rouge). (B) embryon (stade de HH8) est étiqueté avec une sonde DIG-Pax6 (bleu) et une sonde FITC-Chut (rouge). Nf, neurales pli, ANP, plaque neurale antérieure, PSM, mésoderme presomitic, n, notochorde, NT, du tube neural). Cadeaux de la sonde dans les laboratoires des Drs. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, et J. Briscoe. 
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Discussion
Le support 2-couleur d'ensemble de méthode d'hybridation in situ est utilisée pour déterminer à la fois la répartition spatiale et temporelle de l'expression génique, en utilisant un ou deux gènes d'intérêt. Les applications incluent l'évaluation des profils d'expression génique de nouveaux gènes (par exemple 1,2, ainsi que des changements dans l'expression des gènes insulte suivantes (manipulations d'embryons 3, 4 perles, et l'électroporation d'ADN ou d'ARN des constructions 5).
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation Margaret M. Alkek au RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
