Summary
Denna video visar 2-färg hela montera in situ hybridisering, en metod som den rumsliga och tidsmässiga uttryck mönster av 2 olika gener kan visualiseras i ung kycklingembryon. Denna metod introducerades ursprungligen av David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham och David Ish-Horowicz.
Abstract
Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera genuttryck i hjärnan, neuralrörsdefekter, somit och hjärta primordia formation. Denna video visar de olika stegen i 2-färg hela montera in situ hybridisering, det första är embryot skäras ut från ägget och fasta i paraformaldehyd. För det andra är embryot behandlas för prehybridization. Embryot är då hybridiseras med två olika sonder, en kombination att gräva, och en kopplad till FITC. Efter en natt hybridisering, är embryot inkuberas med DIG kopplad antikropp. Färgreaktion för dig substrat sker, och regionen av intresse visas blått. Embryot inkuberas sedan med FITC kopplad antikropp. Embryot behandlas för färgreaktion med FITC, och regionen av intresse visas rött. Slutligen är embryot fast och behandlas för phtograph och sektionering. En felsökningsguide presenteras också.
Protocol
Del 1: Fastställande av embryon
- Fyll dissektion fat med iskall DEPC-PBS. Håll på is. Öppna ägget genom att knacka på skalet med pincett och ta bort skal bitar.
- Ta bort tjocka albumin med pincett. Tilt gulesäcken med grovt pincett så att embryot vänd uppåt.
- Med sax, klippa en kvadrat med gulesäcken runt embryot.
- Använda sked, ta bort embryot från äggula och lägg på iskalla DEPC-PBS.
- Under mikroskop, ta bort membran och äggula och transfer till fixering maträtt.
- Pin ner, ta bort DEPC-PBS. Ersätt med 4% PFA i DEPC-PBS och fixa O / N vid 4 ° C.
- Ta bort fixativ. Ersätt med iskall DEPC-PBS. Med hjälp av en trubbig slutet microcapillary nål eller en microdissection kniv, perforera nervsystemet och håligheter hjärtat, för att förhindra fångst av sond.
- Tvätta 2x 10 minuter DEPC-PBS med 0,1% Tween-20 (PBT). Torka 10 minuter vardera i 25%, 50%, 75% metanol i PBT. Torka embryon två gånger i 100% metanol. Förvara vid -20 ° C i metanol.
Del 2: Prehybridization
- Rehydrera embryon 10 minuter vardera i 75%, 50% och 25% metanol i PBT. Tvätta 2x 10 mn i PBT.
- Under tiden förbereder iskall fixativ (4% paraformaldehyd i PBT). Byt PBT med proteinas K-lösning (3 ml / flaska, [? 5 g / ml] final i PBT). Se till att hela flaskan utsätts för proteinas K lösningen genom att försiktigt rulla injektionsflaskan, se Felsökning för exponeringstider.
- Använda RNas gratis pasteurpipett bort proteinas K och lägga fixativ (2 ml). Placera omedelbart på is i exakt 20 minuter.
- Alla RT tvättar utförs på nutator. Tvätta 2x 10 mn i PBT, och 1x 10min i PBT innehåller 50% hybridisering buffert.
- Tvätta 1x i hybridisering buffert. Inkubera vid 65 ° C i 2 ml hybridisering buffert för 4-5 tim.
Del 3: hybridisera embryon med prober
- Gräva och FITC kopplad sond syntesen beskrivs i tillägg. Sonden förväntas ge en stark signal, bör synhesized med FITC innehåller nukleotider, den svagare sonden ska syntetiseras med med DIG innehåller nukleotider.
- Prewarm sonder i hybridisering buffert (500 ng / ml vardera) med en 2 ml injektionsflaska. Genast ersätta hybridisering buffert med sonden lösningen. Låt inte embryon torka. Inkubera i 16 timmar vid 65 ° C.
- Byt sond med hybridisering buffert, 2 tvättar, 30 min vardera vid 65 ° C. Tvätta 15 mn i hybridisering buffert / MABT (1 / 1 v / v /) vid 65 ° C.
Del 4: DIG antikropp inkubation och färgreaktion
- Tvätta 2x20 mn i MABT. Tvätta 1 timme hos 2% BBR / MABT. Tvätta 5 hr i 2% BBR/20% HISS / MABT (blockerande buffert). Inkubera i 1:2000 DIG antikroppar spätts i blockerande buffert, O / N vid 4 ° C på nutator.
- Tvätta 3x 10 minuter vardera i MABT och 3x 1 timme vardera MABT.
- Tvätta 2x 20 mn i NTMT. Lägg 200ul NBT / BCIP substrat till 10 ml NTMT. Omedelbart ta bort NTMT ur flaskan och ersätt med 1-2 ml NBT / BCIP buffert. Placera i mörker. Övervaka färg reaktion efter 20 min, och 20 min därefter.
- Efter färgreaktion (ska visas blå), tvätta i PBS för 10 minuter, stift ner på fixering tallrik fylld med PBS, och ersätta lösning med 4% PFA i PBS. Fix O / N vid 4 ° C.
- Transfer till nya scintillation flaskan. Tvätta i PBST (PBS med 1% Tween-20) 2x10 minuter. Tvätta i MABT 2x 10 minuter.
- Inkubera i MABT 30 min vid 63 ° C.
Del 5: FITC-antikroppar inkubation och färgreaktion
- Tvätta 2x 10 mn i MABT, 1 timme hos 2% BBR / MABT, 5 timmar i en blockerande buffert
- Inkubera i alkalisk fosfatas-kopplad anti-FITC-antikroppar (1:500) O / N vid 4 ° C.
- Tvätta 3x 10 minuter vardera i MABT och 3x 1 timme vardera MABT.
- Tvätta i 2x 20 mn i TBS pH 8,45 med 0,1% Tween-20 (TBST).
- Förbered Vector Röd arbetar lösning (5 ml) i TBST använda reagenser 1,2 och 3 ges i satsen. Omedelbart ta bort TBST ur flaskan och ersätt med Vector Red buffert. Placera i mörker. Övervaka färgreaktion efter 40 MN, och vid 30 min mellanrum därefter.
- Efter färgreaktion (ska visas röd), överföring embryon till PBS.
Del 6: fixering och bearbetning
- Transfer till fixering maträtt som innehåller PBS, och fixa i 4% PFA för 20 mn på RT eller O / N vid 4 ° C.
- Tvätta i PBS, 2x 10 minuter. För att processen för fotografering, överföring till 20% glycerol i PBS (detta kommer att göra embryon genomskinliga). För att skapa en kammare, skär 2 remsor av PVC-tejp, lägga dem på bild. Skär en fyrkant i mitten med ett blad. Ta torget med hjälp av pincetten.
- För att processen för vax sektionering, transport tillbaka till PBS, tvätta 2x 10 minuter, torkar i graderade serier av metanol (25%, 50%, 75% och 100% i PBS, 10 minuter vardera).
- Ersätt med propanol, 3mn. Ersätt med 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, följt 20 MN Av Histoclear (2x 1 tim). Ersätt med histoclear / vax 1 / 1 (v / v) 60 ° C under 1 timme. Ersätt med vax en processför histologi.
Del 7: Lösningar
Hybridisering bufferten förvaras vid -20 ° C i Falcon, 50 ml: 25 ml formamid, 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 EDTA), 1 ml (10% Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) , 125 ul (20mg/ml tRNA). 100ul (50 mg / ml heparin) MABT, förbereda 100mm maleinsyra, pH till 7,5 med NaOH pellets. Lägg 150mm NaCl och 0,1% Tween-20.
NTMT (gjort precis före användning), 50 ml: 1 ml (5M NaCl), 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (10% Tween-20).
TBST: 0,1 miljoner Tris-HCl, 0,15 NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.
Del 8: Felsökning
| Problem | Orsak | Remedy |
|---|---|---|
| Embryo är böjt upp | Otillräcklig uttorkning / rehydrering | Behåll 10 minuter intervaller under successiva uttorkning / rehydrering steg |
| Det finns ingen sond signal | Probe bryts ned RNas föroreningar i flaskan | Kör sond på 1% agarosgel Se till att hela flaskan utsätts för proteinas K-lösning i steg 2 |
| Probe är etiketter hålrum i hjärtat en neuralrörsdefekter | Probe är instängd | I steg 2, se till att alla hålrum är perforerade med microdissection kniv eller microcapillary |
| Embryo upplöstes efter hybridisering (steg 3) | Proteinas K steg kvar för länge Hybridisering temperaturen är för hög | Proteinas K bör inte lämnas längre än 1mn (steg 3 + och 4), 2 MN (steg 5 till 7), 3 MN (steg 8-10), 4 MN (stadium 11-13) Har hybridisera inte vid T o högre än 65 ° C |
Del 9: representativa resultat
Representant embryon visas nedan: (A) Embryo (etapp HH7) är märkt med en DIG-Sox sond (blå) och en FITC-delta-1 sond (röd). (B) Embryo (etapp HH8) är märkt med en DIG-Pax6 sond (blå) och en FITC-Shh sond (röd). Nf, neurala gånger, ANP, främre neurala plattan, PSM, presomitic mesoderm, n, notochord, NT, neuralrörsdefekter). Probe gåvor från laboratorier Dr. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, och J. Briscoe. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den 2-färg hela montera in situ hybridisering metoden används för att bestämma både rumsliga och tidsmässiga mönster av genuttryck, med en eller två gener av intresse. Applikationer inkluderar bedömning av mönster genuttryck av nya gener (t.ex. 1,2, liksom förändringar i genuttryck efter förolämpning (embryonala manipulationer 3, pärlor 4 och elektroporation av RNA eller DNA konstruktioner 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
