Summary
Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.
Abstract
Der Hühnerembryo ist ein wertvolles Werkzeug in der Studie der frühen Embryonalentwicklung. Seine Transparenz, Zugänglichkeit und einfache Handhabung machen ihn zu einem idealen Werkzeug zur Untersuchung der Genexpression im Gehirn, Neuralrohr, Somiten und Herz Primordien Bildung. Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte in 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung; Erste, der Embryo aus dem Ei präpariert und fixiert in Paraformaldehyd. Zweitens ist der Embryo für Prähybridisierung verarbeitet. Der Embryo wird dann mit zwei verschiedenen Sonden, einer gekoppelten DIG, und man gekoppelt an FITC hybridisiert. Nach einer Hybridisierung über Nacht wird der Embryo mit DIG-gekoppelten Antikörper inkubiert. Farbreaktion für DIG Substrat durchgeführt wird, und die Region von Interesse blau erscheint. Der Embryo wird dann mit FITC gekoppelten Antikörper inkubiert. Der Embryo ist für Farbreaktion mit FITC verarbeitet, und die Region von Interesse erscheint rot. Schließlich ist der Embryo fixiert und phtograph verarbeitet und Schneiden. Ein Leitfaden für die Fehlersuche wird ebenfalls vorgestellt.
Protocol
Teil 1: Befestigung des Embryos
- Füllen Sie Dissektion Schüssel mit eiskaltem DEPC-PBS. Keep on ice. Öffnen Sie das Ei, indem Sie die Schale mit einer Pinzette entfernen und Shell Stücke.
- Entfernen Sie dicke Albumin mit einer Pinzette. Tilt Dottersack mit groben Pinzette so, dass Embryos nach oben zeigt.
- Mit Schere, schnitt ein Quadrat der Dottersack rund um den Embryo.
- Mit Löffel entfernen Embryo aus Eigelb und auf Eis kalt DEPC-PBS.
- Unter dem Mikroskop entfernen Membranen und Eigelb und Transfer zum Fixieren Gericht.
- Pin nach unten, zu entfernen DEPC-PBS. Ersetzen mit 4% PFA in DEPC-PBS und fixieren O / N bei 4 ° C.
- Entfernen Fixativ. Ersetzen Sie mit eiskaltem DEPC-PBS. Mit einem stumpfen Ende Mikrokapillare Nadel oder ein Mikrodissektion Messer, perforieren das Nervensystem und das Herz Hohlräumen, zum Einfangen der Sonde zu verhindern.
- Wash 2x 10 Minuten DEPC-PBS mit 0,1% Tween-20 (PBT). Entwässern 10 mn jeweils in 25%, 50%, 75% Methanol in PBT. Entwässern Embryonen zweimal in 100% Methanol. Lagerung bei -20 ° C in Methanol.
Teil 2: Prähybridisierung
- Rehydrieren Embryonen 10 Minuten jeweils in 75%, 50% und 25% Methanol in PBT. Wash 2x 10 min in PBT.
- In der Zwischenzeit bereiten eiskalt Fixativ (4% Paraformaldehyd in PBT). Ersetzen PBT mit Proteinase K-Lösung (3 ml / Flasche; [? 5 g / ml] Finale in PBT). Achten Sie darauf, das gesamte Gefäß mit Proteinase K-Lösung wird durch sanften das Fläschchen ausgesetzt, finden Sie unter Problembehandlung für Belichtungszeiten.
- Mit RNase frei Pasteurpipette entfernen Proteinase K und fügen Fixativ (2 ml). Sofort auf Eis Platz für genau 20 Minuten.
- Alle RT wäscht auf Kolbenpendel durchgeführt. Wash 2x 10 min in PBT, und 1x 10mn in PBT mit 50% Hybridisierungspuffer.
- Wash 1x in Hybridisierungspuffer. Inkubation bei 65 ° C in 2 ml Hybridisierungspuffer für 4-5 Stunden.
Teil 3: hybridisieren Embryonen mit Sonden
- DIG und FITC gekoppelt Sonde Synthese ist in Anhang A beschrieben. Die Sonde soll ein starkes Signal zu geben, sollte mit FITC-haltigen Nucleotiden synhesized werden, die schwächeren Sonde sollte mit mit DIG-haltigen Nucleotiden synthetisiert werden.
- Vorwärmen Sonden in Hybridisierungspuffer (500 ng / ml) mit einer 2 ml-Fläschchen. Umgehend zu ersetzen Hybridisierungspuffer mit der Sonde Lösung. Lassen Sie sich nicht die Embryonen trocken. Inkubieren für 16 h bei 65 ° C.
- Ersetzen Sonde mit Hybridisierungspuffer, 2 Wäschen, 30 mn jeweils bei 65 ° C. Wash 15 mn in Hybridisierungspuffer / MABT (1.1 v / v /) bei 65 ° C.
Teil 4: DIG Antikörper-Inkubation und Farbreaktion
- Wash 2x20 Min. in MABT. Wash 1 h in 2% BBR / MABT. Wash 5 Stunden in 2% BBR/20% HISS / MABT (Blocking-Puffer). Inkubieren in 1:2000 DIG-Antikörper in Blocking-Puffer verdünnt, O / N bei 4 ° C auf Kolbenpendel.
- 3x 10 Minuten jeweils in MABT und 3x 1 Stunde jeweils in MABT.
- Wash 2x 20 Minuten in NTMT. Add 200 &mgr; l NBT / BCIP Substrat 10 ml NTMT. Unverzüglich entfernen NTMT von Fläschchen und ersetzen mit 1-2 ml NBT / BCIP-Puffer. Legen Sie im Dunkeln. Monitor Farbreaktion nach 20 Minuten und bei 20 mn Abständen.
- Nach Farbreaktion (sollte erscheinen blau), in PBS waschen für 10 Minuten, festzunageln auf Fixierung Schale mit PBS gefüllt, und ersetzen Lösung mit 4% PFA in PBS. Fix O / N bei 4 ° C.
- Transfer zum neuen Scintillationsfläschchen. Wash in PBST (PBS mit 1% Tween-20) 2x10 mn. Wash in MABT 2x 10 Minuten.
- Inkubieren in MABT 30 mn bei 63 ° C.
Teil 5: FITC Antikörper-Inkubation und Farbreaktion
- Wash 2x 10 Minuten in MABT, 1 Stunde in 2% BBR / MABT, 5 Stunden in Blocking-Puffer
- Inkubieren in alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-FITC-Antikörper (1:500) O / N bei 4 ° C.
- 3x 10 Minuten jeweils in MABT und 3x 1 Stunde jeweils in MABT.
- Wash in 2x 20 Minuten in TBS pH 8,45 mit 0,1% Tween-20 (TBST).
- Bereiten Vector Red funktionierende Lösung (5 ml) in TBST mit Reagenzien 1,2 und 3 in Kit zur Verfügung gestellt. Unverzüglich entfernen TBST von Fläschchen und ersetzen mit Vector Red-Puffer. Legen Sie im Dunkeln. Monitor Farbreaktion nach 40 mn, und bei 30 mn Abständen.
- Nach Farbreaktion (sollte erscheinen rot),-Embryonen zu PBS.
Teil 6: Fixation und Verarbeitung
- Transfer zum Fixieren Schale mit PBS und fix in 4% PFA für 20 Minuten bei RT oder O / N bei 4 ° C.
- Wash in PBS, 2x 10 Minuten. Für die Verarbeitung für die Fotografie, um 20% Glycerin in PBS (das macht die Embryonen transluzent) zu übertragen. So erstellen Sie eine Kammer, 2 Streifen aus PVC-Band, überlagern sie auf Folie. Schneiden Sie ein Quadrat in der Mitte mit einem Messer. Entfernen Sie den Platz mit einer Pinzette.
- Zur Bearbeitung für Wachs Schneiden, Transfer zurück zum PBS waschen 2x 10 Minuten, dehydrieren in abgestufte Reihe von Methanol (25%, 50%, 75% und 100% in PBS, 10 min jeweils).
- Ersetzen Sie mit Propanol, 3min. Ersetzen Sie mit 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalin, gefolgt von 20 Minuten Histoclear (2x 1 Std.). Ersetzen durch histoclear / Wachs 1.1 (v / v) 60 ° C für 1 Stunde. Ersetzen mit Wachs-und Prozessfür die Histologie.
Teil 7: Lösungen
Hybridisierungspuffer, Lagerung bei -20 ° C in Falcon, 50 ml: 25 ml Formamid; 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (10% Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100 ul (50 mg / ml Heparin) MABT, bereiten 100 mM Maleinsäure, pH auf 7,5 mit NaOH Pellets. Add 150 mM NaCl und 0,1% Tween-20.
NTMT (made unmittelbar vor der Verwendung), 50 ml: 1 ml (5M NaCl), 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (10% Tween-20).
TBST: 0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.
Teil 8: Fehlersuche
| Problem | Ursache | Abhilfe |
|---|---|---|
| Embryo ist zusammengerollt | Unzureichende Dehydration / Rehydration | Halten Sie 10 Minuten Intervallen während aufeinanderfolgender Dehydration / Rehydration Schritte |
| Es gibt keine Sondensignal | Probe abgebaut wird RNase Kontamination in einem Fläschchen | Run-Sonde auf 1% Agarosegel Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gefäß zu Proteinase K-Lösung wird in Schritt 2 ausgesetzt |
| Probe ist Etiketten Hohlräume Herzen ein Neuralrohr | Probe gefangen ist | In Schritt 2, um sicherzustellen, dass alle Hohlräume perforiert mit Mikrodissektion Messer oder Mikrokapillare |
| Embryo zerfiel nach der Hybridisierung (Schritt 3) | Proteinase K Schritt nach links zu lange Hybridisierung Temperatur zu hoch ist | Proteinase K sollte nicht länger als 1 Mio. gelassen werden (Stufen 3 + und 4), 2 mn (Stufe 5 bis 7), 3 Minuten (Stufe 8-10), 4 mn (Stufe 11-13) Nicht bei T o höhere hybridisieren als 65 o C |
Teil 9: Repräsentative Ergebnisse
Vertreter Embryonen sind unten dargestellt: (A) Embryo (Stadium HH7) ist mit einer DIG-Sox-Sonde (blau) und ein FITC-Delta-1-Sonde (rot) gekennzeichnet. (B) Embryo (Stadium HH8) ist mit einer DIG-Pax6-Sonde (blau) und ein FITC-Shh-Sonde (rot) gekennzeichnet. Nf, neuronale fach, ANP, vorderen Neuralplatte, psm, präsomitischen Mesoderm, n, Chorda, nt, Neuralrohr). Probe Geschenke aus den Labors von Drs. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, und J. Briscoe. 
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Discussion
Die 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung Methode wird verwendet, um sowohl die räumliche und zeitliche Muster der Genexpression zu bestimmen, mit ein oder zwei Gene von Interesse. Zu den Anwendungen gehören Beurteilung der Genexpressionsmuster von neuen Genen (zB 1,2, sowie Veränderungen in der Genexpression nach Beleidigung (embryonale Manipulationen 3, Perlen 4 und Elektroporation von RNA oder DNA-Konstrukte, 5).
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Margaret M. Alkek Stiftung RHF unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
