Summary
यह वीडियो स्वस्थानी संकरण, एक विधि है जिसके द्वारा स्थानिक और लौकिक 2 अलग जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न युवा लड़की भ्रूण में visualized किया जा सकता में 2 रंग पूरे माउंट दर्शाता है. इस पद्धति का मूल दाऊद Wilkinson, डोमिंगोस हेनरिक, फिल Ingham और ईशबोशेत Horowicz डेविड द्वारा पेश किया गया था.
Abstract
लड़की भ्रूण जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इसकी पारदर्शिता, पहुंच, और हेरफेर की आसानी, यह मस्तिष्क, न्यूरल ट्यूब, somite और दिल primordia गठन में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनाते हैं. इस वीडियो स्वस्थानी संकरण में 2 रंग पूरे माउंट में विभिन्न चरणों को दर्शाता है, पहला, भ्रूण अंडे से dissected है और paraformaldehyde में तय है. दूसरा, भ्रूण prehybridization के लिए कार्रवाई की है. भ्रूण तो दो अलग अलग जांच, डीआईजी युग्मित, और एक FITC के लिए युग्मित के साथ संकरित है. रातोंरात संकरण के बाद, भ्रूण डीआईजी युग्मित एंटीबॉडी के साथ incubated है. डीआईजी सब्सट्रेट के लिए रंग की प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया, और ब्याज के क्षेत्र नीले प्रकट होता है. भ्रूण तो FITC एंटीबॉडी के साथ मिलकर incubated है. भ्रूण FITC के साथ रंग की प्रतिक्रिया के लिए कार्रवाई की है, और ब्याज के क्षेत्र लाल प्रकट होता है. अंत में, भ्रूण तय है और संसाधित और phtograph लिए सेक्शनिंग. समस्या निवारण मार्गनिर्देशिका भी प्रस्तुत किया है.
Protocol
भाग 1: भ्रूण फिक्सिंग
- बर्फ depc पीबीएस ठंड के साथ विच्छेदन पकवान भरें. बर्फ पर रखें. संदंश के साथ खोल दोहन द्वारा अंडे खोलें और खोल के टुकड़े को हटाने.
- संदंश के साथ albumin मोटी निकालें. मोटे संदंश के साथ जर्दी थैली झुकाएँ ताकि भ्रूण ऊपर की तरफ चेहरे.
- कैंची का प्रयोग, जर्दी थैली भ्रूण के आसपास के एक वर्ग में कटौती.
- चम्मच का प्रयोग, जर्दी और बर्फ depc पीबीएस ठंड जगह से भ्रूण को हटा दें.
- खुर्दबीन के तहत, झिल्ली और जर्दी हटाने और निर्धारण पकवान करने के लिए स्थानांतरण.
- नीचे पिन, depc - पीबीएस हटायें. Depc - पीबीएस में पीएफए 4% के साथ बदलें और 4 पर / ओ एन तय डिग्री सेल्सियस
- लगानेवाला निकालें. बर्फ depc पीबीएस ठंड के साथ बदलें. एक कुंद अंत microcapillary सुई या एक microdissection चाकू का प्रयोग, तंत्रिका तंत्र और हृदय cavities छेदना, जांच के फँसाने को रोकने.
- 0.1% बीच 20 (पीबीटी) के साथ 2x 10 depc - पीबीएस करोड़ धो लें. 10 करोड़ का 25%, 50%, पीबीटी में 75% मेथनॉल में प्रत्येक निर्जलीकरण. 100% मेथनॉल में भ्रूण दो बार निर्जलीकरण. -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में स्टोर.
भाग 2: Prehybridization
- भ्रूण 75%, 50% और पीबीटी में 25% मेथनॉल में 10 करोड़ rehydrate प्रत्येक. पीबीटी में 2x 10 करोड़ धो लें.
- इस बीच, बर्फ ठंड लगानेवाला (पीबीटी में 4% paraformaldehyde) तैयार करते हैं. पीबीटी proteinase कश्मीर समाधान (; अंतिम पीबीटी में [5 / छ मिलीलीटर?] 3 मिलीग्राम / शीशी) के साथ बदलें. यकीन है कि पूरे शीशी धीरे शीशी रोलिंग द्वारा proteinase कश्मीर समाधान के लिए उजागर हो रहा है, जोखिम बार के लिए समस्या निवारण देख.
- RNase मुक्त पाश्चर विंदुक हटायें proteinase कश्मीर का प्रयोग और लगानेवाला (2 एमएल) जोड़ें. तुरंत वास्तव में 20 करोड़ के लिए बर्फ पर जगह है.
- सभी आरटी washes nutator पर प्रदर्शन कर रहे हैं. 2x पीबीटी में 10 करोड़, और 50% युक्त संकरण बफर पीबीटी में 1x 10mn धो लें.
- संकरण बफर में 1x धो. 65 में सेते ° सी में 4-5 घंटे के लिए 2 मिलीलीटर संकरण बफर.
भाग 3: जांच के साथ संकरण भ्रूण
- डीआईजी और FITC युग्मित जांच संश्लेषण परिशिष्ट में वर्णित है. जांच करने के लिए एक मजबूत संकेत देने की उम्मीद, FITC युक्त nucleotides के साथ synhesized होना चाहिए, कमजोर जांच डीआईजी युक्त nucleotides के साथ साथ संश्लेषित किया जाना चाहिए.
- संकरण बफर में Prewarm जांच (500 एनजी / मिलीलीटर प्रत्येक) एक 2 मिलीलीटर की शीशी का उपयोग. तुरंत जांच के समाधान के साथ संकरण बफर जगह. भ्रूण सूखी मत देना. 65 में 16 घंटा के लिए सेते ° सी.
- संकरण बफर, 2 washes, 30 करोड़ 65 में प्रत्येक डिग्री सेल्सियस के साथ जांच बदलें संकरण बफर / MABT में 15 करोड़ 65 में (1 / ध् 1 / v /) धो डिग्री सेल्सियस
भाग 4: डीआईजी एंटीबॉडी ऊष्मायन और प्रतिक्रिया रंग
- MABT में 2x20 करोड़ धो लें. 1 घंटे 2% / BBR MABT में धो लें. 2% में 5 घंटा धो BBR/20% / फुफकार MABT (बफर अवरुद्ध). 1:2000 डीआईजी अवरुद्ध बफर में पतला एंटीबॉडी में सेते हैं, हे / N 4 बजे ° सी nutator पर.
- धो 3x MABT में 10 प्रत्येक करोड़, और 3x 1 घंटा MABT में प्रत्येक.
- NTMT में 2x 20 करोड़ धो लें. 10 मिलीलीटर NTMT 200ul सब्सट्रेट / एनबीटी BCIP जोड़ें. तुरंत शीशी से NTMT हटाने और 1-2 मिलीलीटर / एनबीटी BCIP बफर के साथ बदलें. अंधेरे में रखें. 20 करोड़ के बाद रंग प्रतिक्रिया मॉनिटर, और 20 करोड़ अंतराल पर उसके बाद.
- रंग प्रतिक्रिया (नीले प्रकट चाहिए) के बाद, पीबीएस में 10 करोड़ के लिए धोने, निर्धारण पीबीएस के साथ भरा पकवान पर नीचे पिन, और पीएफए पीबीएस में 4% के साथ समाधान की जगह. ओ एन / 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्स
- नए जगमगाहट शीशी के लिए स्थानांतरण. 2x10 करोड़ (1% बीच-20 के साथ पीबीएस) PBST में धो. MABT 2x 10 करोड़ में धो डालें.
- 63 डिग्री सेल्सियस पर MABT करोड़ 30 में सेते
भाग 5: FITC एंटीबॉडी ऊष्मायन और प्रतिक्रिया रंग
- 2x MABT में 10 करोड़, 2% में 1 घंटा धो BBR / MABT, अवरुद्ध बफर में 5 घंटा
- Alkaline फॉस्फेट मिलकर विरोधी FITC - एंटीबॉडी (1:500) ओ एन / 4 में डिग्री सेल्सियस में सेते
- धो 3x MABT में 10 प्रत्येक करोड़, और 3x 1 घंटा MABT में प्रत्येक.
- टीबीएस पीएच 8.45 में 2x करोड़ 20 में 0.1% बीच 20 (TBST) के साथ धोएं.
- TBST 1,2 और 3 अभिकर्मकों किट में दिए का उपयोग करने में वेक्टर लाल काम कर समाधान (5 एमएल) तैयार करें. तुरंत शीशी से TBST हटाने और वेक्टर रेड बफर के साथ बदलें. अंधेरे में रखें. 40 करोड़ के बाद रंग, और प्रतिक्रिया पर 30 करोड़ उसके बाद अंतराल मॉनिटर.
- बाद रंग (लाल दिखाई चाहिए) प्रतिक्रिया, पीबीएस के लिए हस्तांतरण भ्रूण.
भाग 6: फिक्सेशन और प्रसंस्करण
- पीबीएस युक्त निर्धारण पकवान स्थानांतरण, और 4 में 20 करोड़ आरटी या / ओ एन के लिए 4% पीएफए में ठीक डिग्री सेल्सियस
- Pbs, 2x 10 करोड़ में धो डालें. फोटोग्राफी के लिए प्रक्रिया, पीबीएस में 20% ग्लिसरॉल (इस भ्रूण पारभासी कर देगा) को हस्तांतरण. एक कक्ष बनाने, पीवीसी टेप के 2 स्ट्रिप्स में कटौती, उन्हें स्लाइड पर रखना. एक ब्लेड का उपयोग करते हुए केंद्र में एक वर्ग कट. वर्ग का उपयोग संदंश निकालें.
- मोम सेक्शनिंग के लिए प्रक्रिया करने के लिए, Pbs, धोने 2x करोड़ 10 के लिए वापस हस्तांतरण, मेथनॉल (25%, 50%, 75% और पीबीएस में 100%, 10 करोड़ का प्रत्येक) की वर्गीकृत श्रृंखला में निर्जलीकरण.
- Propanol, 3mn के साथ बदलें. 1,2,3,4 - tetrahydronaphthalene के साथ बदलें, 20 करोड़ Histoclear (1 2x घंटा) द्वारा पीछा किया. 1 घंटे के लिए / histoclear मोम 1 / 1 (v / v) 60 डिग्री सेल्सियस के साथ बदलें. एक प्रक्रिया मोम के साथ बदलेंऊतक विज्ञान के लिए.
भाग 7: समाधान
संकरण बफर -20 में दुकान, ° फाल्कन में सी, 50 मिलीलीटर: 25 मिलीलीटर formamide, 3.25 मिलीलीटर (20xSSC); 0.5 मिलीलीटर (0.5m EDTA), 1 मिलीलीटर (10% बीच 20), 2.5 मिलीलीटर (1% एसडीएस) , 125 (20mg/ml tRNA) उल;. MABT 100ul (50 हेपरिन मिलीग्राम / एमएल), 100mm Maleic एसिड तैयार; NaOH छर्रों के साथ पीएच 7.5 करने के लिए. 150mm NaCl और 0.1% बीच 20 जोड़ें.
NTMT (बस बनाया उपयोग करने के लिए पूर्व), 50 मिलीलीटर: 1ml (5M NaCl); 2.5 मिलीलीटर (2M pH9.5 Tris - एचसीएल); 1.25 मिलीलीटर (2M MgCl 2), 5 मिलीलीटर (10% बीच 20).
TBST: Tris - एचसीएल 0.1M, 0.15M NaCl, पीएच 8.45, 0.1% बीच 20.
8 पार्ट: समस्या निवारण
| समस्या | कारण | उपाय |
|---|---|---|
| भ्रूण अप कर्ल करवाने है | अपर्याप्त निर्जलीकरण / पुनर्जलीकरण | लगातार निर्जलीकरण / पुनर्जलीकरण चरणों के दौरान 10 करोड़ का अंतराल बनाए रखें |
| वहाँ कोई जांच का संकेत है | जांच शीशी में अपमानित RNase संदूषण है | भागो 1% agarose जेल पर जांच सुनिश्चित करें कि पूरे शीशी proteinase कश्मीर समाधान के लिए चरण 2 में अवगत कराया है |
| दिल की जांच लेबल एक न्यूरल ट्यूब cavities है | जांच फंस | चरण 2 में, सुनिश्चित करें कि सभी cavities microdissection चाकू का उपयोग कर छिद्रित रहे हैं बनाने के लिए या microcapillary |
| भ्रूण निम्नलिखित संकरण (कदम 3) विघटित | Proteinase कश्मीर कदम छोड़ भी लंबे समय के संकरण तापमान बहुत अधिक है | Proteinase कश्मीर 1mn की तुलना में अब नहीं छोड़ा (3 चरणों + और 4), 2 (5 से 7 चरण) mn, 3 (8-10 चरण) करोड़, 4 करोड़ (11-13 मंच) टी ओ पर उच्च नहीं संकरण 65 ओ सी से |
भाग 9: प्रतिनिधि परिणाम
प्रतिनिधि भ्रूण नीचे दिखाया गया हैं: (ए) भ्रूण (HH7 चरण) के एक डीआईजी Sox (नीला) जांच और एक FITC - डेल्टा-1 (लाल) जांच के साथ लेबल है. (बी) भ्रूण (HH8 चरण) के एक डीआईजी Pax6 (नीला) जांच और जांच FITC श्श्श (लाल) के साथ लेबल है. NF, तंत्रिका, गुना, एएनपी, पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट, PSM, presomitic mesoderm, n, notochord, NT, न्यूरल ट्यूब). डीआरएस के प्रयोगशालाओं से जांच उपहार. सी. Tabin, एम. Goulding, डी. हेनरिक, और जे Briscoe. 
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Discussion
2 रंग में पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण विधि जीन अभिव्यक्ति की दोनों स्थानिक और लौकिक पैटर्न को निर्धारित करने के लिए, ब्याज की एक या दो जीनों का उपयोग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आवेदन जीन उपन्यास जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन (1,2 जैसे, के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीन अभिव्यक्ति निम्न अपमान में परिवर्तन (भ्रूण जोड़तोड़ 3, मोती 4, और शाही सेना या डीएनए की electroporation 5 constructs) शामिल हैं.
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Acknowledgments
यह काम मार्गरेट एम. Alkek RHF फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
