Summary
このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ- Horowiczによって導入された。
Abstract
ニワトリ胚は、初期胚発生の研究に貴重なツールです。その透明性、アクセス性と操作の容易さ、それを脳、神経管、体節、心臓原基の形成における遺伝子発現を研究するための理想的なツールとなっています。このビデオでは、in situハイブリダイゼーションの2色全体のマウントで別の手順を示し、まず、胚は卵から解剖し、パラホルムアルデヒドで固定されています。第二に、胚は、プレハイブリダイゼーションのために処理されます。胚は、2つの異なるプローブを、DIGに結合された1つ、およびFITCに結合された1つでハイブリダイズさせる。一晩ハイブリダイゼーション後、胚はDIG結合抗体とインキュベートされる。 DIG基板用色反応を行い、関心領域は青色表示されます。胚は、その後、FITC結合抗体とインキュベートされる。胚は、FITCによる呈色反応のために処理、および関心領域は、赤色表示されます。最後に、胚はphtographとセクショニングの固定され、処理されます。トラブルシューティングガイドも表示されます。
Protocol
パート1：胚を修正
- 氷冷DEPC - PBSで解剖皿を埋める。氷上に置きます。ピンセットで殻をタップして卵を開いて、シェルの部分を削除してください。
- 鉗子によるアルブミン厚い取り外します。その胚が上向きに向くように粗い鉗子で卵黄嚢を傾けて。
- はさみを使って、胚の周りに卵黄嚢の正方形をカット。
- スプーンを使用して、氷冷DEPC - PBSで卵黄と場所から胚を削除します。
- 顕微鏡下で、膜と卵黄を削除し、固定の皿に移す。
- 突き止める、DEPC - PBSを除去。 DEPC - PBSで4％PFAで置き換えると4でO / Nを修正℃に
- 固定液取り外します。氷冷DEPC - PBSに交換してください。平滑末端マイクロキャピラリーニードルまたはマイクロダイセクションのナイフを使用して、プローブのトラッピングを防ぐために、神経系および心腔を穿孔する。
- 0.1％のTween - 20（PBT）と2倍の10分DEPC - PBSを洗ってください。 25％、50％、PBTで75％メタノールで各10分を脱水する。 100％メタノールで二回胚を脱水する。メタノールで-20℃で保存。
パート2：プレハイブリダイゼーション
- PBTで75％、50％、25％メタノールでそれぞれの胚を10分を再水和。 PBTの2倍の10分を洗ってください。
- 一方、氷冷固定液（PBTで4％パラホルムアルデヒド）を準備する。プロテイナーゼK溶液（; [か5 g / mlの]最後のPBTの3ミリリットル/バイアル）とPBTを交換してください。全体バイアルを静かにバイアルを圧延してプロテイナーゼK溶液にさらされていることを確認します。露光時間のトラブルシューティングを参照してください。
- RNaseフリーパスツールピペット削除プロテイナーゼKを使用し、固定液（2 ml）を加える。すぐに正確に20分、氷上に置きます。
- すべてのRTの洗浄はnutator上で実行されます。 2倍のPBTで10分、および50％のハイブリダイゼーションバッファーを含むPBTの1X 10mnを洗ってください。
- ハイブリダイゼーションバッファーで1倍を洗ってください。 65℃でインキュベート4〜5時間、2 mlのハイブリダイゼーションバッファー中のC。
パート3：プローブとハイブリダイズ胚
- DIGとFITC結合プローブの合成は、付録Aで説明されています。強い信号を与えると予想プローブは、FITC含有ヌクレオチドでsynhesizedされるべきである;弱いプローブは、DIG -を含むヌクレオチドとを用いて合成する必要があります。
- 2mlのバイアルを使用してハイブリダイゼーションバッファーにPrewarmプローブ（500 ng / mlの各）。速やかにプローブ溶液とハイブリダイゼーションバッファーを交換してください。胚は乾燥させないでください。 65℃16時間インキュベート℃に
- ハイブリダイゼーション緩衝液、2回洗浄、30分65℃の各℃でプローブを交換してください65でハイブリダイゼーション緩衝液/ MABT（1 / 1 V / V /）で15分を洗う℃に
パート4：DIG抗体のインキュベーションと呈色反応
- MABTで2 ×分を洗浄する。 2％BBR / MABTで1時間を洗います。 2％で5時間を洗うBBR/20％HISS / MABT（ブロッキングバッファー）。ブロッキングバッファーで希釈1:2000 DIG抗体でインキュベートし、4℃でO / N ° nutatorでC。
- MABTの3倍の10分ごと、および3倍の1時間MABT内の各を洗う。
- NTMTの2倍の20分を洗ってください。 10 mlのNTMTに200ulのNBT / BCIP基質を追加。すぐにバイアルからNTMTを削除し、1〜2ミリリットルNBT / BCIPバッファーと交換してください。暗闇の中で場所。その後20分後、および20分間隔で呈色反応を監視する。
- 呈色反応（青色表示される）に続いて、10分のためにPBSで洗浄し、PBSで満たした固定皿に突き止める、そしてPBS中4％PFAでソリューションを交換してください。 4℃でO / N℃を修正
- 新しいシンチレーションバイアルに移す。 2 × 10分（1％のTween - 20を含むPBS）PBSTで洗浄する。 MABT 2倍10分で洗浄する。
- 63℃でMABT 30分でインキュベート
パート5：FITC抗体のインキュベーションと呈色反応
- MABTの2倍10分、2％BBR / MABT、ブロッキング緩衝液で5時間の1時間を洗う
- アルカリホスファターゼ結合抗FITC -抗体（1:500）で4 O / N ° Cでインキュベートする
- MABTの3倍の10分ごと、および3倍の1時間MABT内の各を洗う。
- 0.1％のTween - 20（TBST）でTBS pHは8.45で2倍の20分で洗浄する。
- キットに含まれる試薬1,2および3を使用してTBSTでベクトルレッドワーキング溶液（5 ml）を準備する。すぐにバイアルからTBSTを削除し、ベクトルレッドバッファーと交換してください。暗闇の中で場所。 40分後、およびその後30分間隔で呈色反応を監視する。
- 以下の呈色反応（赤色表示されているはずです）、PBSに転送胚。
第6部：固定および処理
- PBSを含む固定の皿に移し、そして4℃、RTまたはO / Nで約20分を4％PFAで固定し℃の
- PBS、2倍の10分で洗浄する。写真撮影のために処理するために、PBS中の20％グリセロール（これは、胚を半透明になる）に移す。チャンバーを作成するには、PVCテープの2ストリップをカット、スライド上に重ね合わせる。ブレードを使用して中央に正方形をカット。鉗子を使って正方形を削除します。
- ワックスのセクショニングのために処理するために、メタノールの段階的な一連の（25％、50％、75％、PBSで100％、10分ごと）で水分を取り除き、PBS、洗浄2倍の10分に戻って転送する。
- プロパノール、3MNと交換してください。 Histoclear（2 × 1時間）に続いて1,2,3,4 - テトラヒドロナフタレン、約20分で交換してください。 1時間histoclear /ワックス1 / 1（v / v）を60 ° Cで置き換えます。ワックスを使用してプロセスを置き換える組織学用。
パート7：ソリューション
-20ハイブリダイゼーション緩衝液、店舗°ファルコンでC、50 mlの25 mlのホルムアミド、3.25ミリリットル（20xSSC）、0.5ミリリットル（0.5M EDTA）、1ミリリットル（10％のTween - 20）、2.5ミリリットル（1％SDS） 、125、UL（20mg/ml tRNA）が、。100ul（50 mg / mlのヘパリン）MABTは、100mMのマレイン酸を用意し、pH7.5にNaOHペレットで。 150mmのNaClおよび0.1％Tween - 20を追加。
NTMT（使用直前に作られた）を、50ml：（5M NaCl）を1ミリリットル、2.5ミリリットル（2Mトリス- HCl pH9.5）、1.25ミリリットル（2MのMgCl 2）、5ミリリットル（10％のTween - 20）。
TBST：0.1Mトリス- HCl、0.15MのNaCl、pHは8.45、0.1％のTween - 20。
パート8：トラブルシューティング
| 問題が | 原因と | 救済策 |
|---|---|---|
| 胚は丸くなっている | 不足して脱水/再水和 | 連続して脱水/再水和ステップの間に10分間隔を維持する |
| プローブの信号はありません | プローブは、バイアルの劣化したRNaseのコンタミです。 | 全体バイアルは、手順2でプロティナーゼK溶液にさらされていることを確認して1％アガロースゲル上でプローブを実行する |
| プローブは、心臓のラベルの空洞神経管です。 | プローブがトラップされ | ステップ2では、すべてのキャビティに穴が使用して顕微解剖ナイフまたはマイクロキャピラリーていることを確認してください |
| 胚は、以下のハイブリダイゼーション（ステップ3）崩壊 | プロテイナーゼKのステップでは、長すぎるハイブリダイゼーションの温度が高すぎるまま | プロテイナーゼKは長い1mn以上のままにしないでください（ステージ3 +と4）、2 MN（ステージ5〜7）、3分（ステージ8-10）、4 mnは（ステージ11-13）より高いT Oでハイブリダイズしないでください。よりも65 ° Cの |
パート9：代表的な結果
代表的な胚を以下に示します：（A）胚（ステージHH7は）DIG -ソックスプローブ（青）とFITC -デルタ- 1プローブ（赤）で標識されている。 （B）胚（ステージHH8は）DIG - Pax6プローブ（青）とFITC - Shhのプローブ（赤）で標識されている。 NF、神経襞、ANP、前方神経板、PSM、前体節中胚葉、nは、脊索、NT、神経管）。博士の研究室からのプローブの贈り物。 C. Tabin、M.グールディング、D.エンリケ、そしてJ.ブリスコー。 
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Discussion
in situハイブリダイゼーション法2色全体のマウントは、関心の1つまたは2つの遺伝子を用いて、遺伝子発現の空間的および時間的パターンの両方を決定するために使用されます。アプリケーションでは、新規遺伝子の遺伝子発現パターンの評価（例えば1,2、だけでなく、遺伝子発現、次の侮辱の変化（胚操作3、ビーズ4、RNAまたはDNAのエレクトロポレーション5構築）が含まれています。
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Acknowledgments
この作品は、RHFへマーガレットM. Alkek財団によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
