Summary
이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.
Abstract
여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브, 체절과 심장 primordia 형성에 유전자 발현을 연구를위한 이상적인 도구가합니다. 이 비디오는 현장 하이브리드화 2 색 전체 마운트에있는 다른 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 배아는 prehybridization에 대한 처리됩니다. 배아는 다음 두 가지 프로브, 팔 결합 하나와 FITC에 결합하여 하나 hybridized입니다. 하룻밤 하이브리드화 다음, 배 (胚)가 발굴 결합 항체와 incubated입니다. 발굴 기판에 대한 컬러 반응이 수행하고, 관심 지역은 파란색으로 나타납니다. 배아는 다음 FITC 항체와 결합 incubated입니다. 배아는 FITC와 색상 반응을 처리하고, 관심 지역은 빨간색으로 나타납니다. 마지막으로, 배아는 고정 및 처리 phtograph과 sectioning입니다. 문제 해결 가이드도 제공됩니다.
Protocol
1 부 : 배아를 고정
- 얼음 추위 depc - PBS로 해부 접시를 채우십시오. 얼음 계속. 포셉로 껍질을 감청하여 계란을 열고 조개 조각을 제거합니다.
- 포셉과 알부민 두꺼운 제거합니다. 그 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉과 난황을 기울이기.
- 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라.
- 숟가락 사용, 얼음 추위 depc - PBS에 노른자와 장소에서 배아를 제거합니다.
- 현미경, 세포막과 노른자를 제거하고 고정 요리로 전송할 수 있습니다.
- 아래로 핀 depc - PBS를 제거합니다. depc - PBS에서 4% PFA로 교체하고 4 O / N를 수정 ° C.
- 정착액 제거합니다. 얼음 추위 depc - PBS로 바꿉니다. 뭉툭한 끝 microcapillary 바늘이나 microdissection 나이프를 이용하여 프로브의 트래핑을 방지하기 위해, 신경계와 심장 충치 구멍.
- 0.1 % 트윈 - 20 (PBT)를 2 배 10 MN depc - PBS 씻으십시오. 25 %, 50 %, PBT의 75 % 메탄올의 각 10 MN을 탈수. 100 % 메탄올 두 번 배아를 탈수. 메탄올에서 -20 ° C에 보관하십시오.
2 부 : Prehybridization
- 75 % 50 % PBT의 25 % 메탄올의 각 배아 10 MN을 Rehydrate. PBT에서 배 10 MN 씻으십시오.
- 한편, 얼음 차가운 정착액 (PBT의 4 % paraformaldehyde)을 준비합니다. proteinase K 용액 (; [? 5g / ML] 마지막 PBT 3 ML / 유리병)와 PBT를 교체하십시오. 전체 유리병이 부드럽게 병을 회전하여 proteinase K 용액에 노출 있는지 확인합니다, 노출 시간에 대한 문제 해결을 참조하십시오.
- RNase 무료 파스퇴르 피펫 제거 proteinase K를 사용하고 정착액 (2 ML)을 추가합니다. 즉시 정확히 20 MN을 위해 얼음에 놓으십시오.
- 모든 RT의 세척은 nutator에서 수행됩니다. 2X PBT 10 미네소타, 그리고 50 %의 하이브리드화 버퍼를 포함하는 PBT에서 1X 10mn 씻으십시오.
- 하이브 리다이 제이션 버퍼 1X 씻으십시오. 65 품어 ° 4-5 시간 2 ML의 하이브리드화 버퍼에 C.
파트 3 : 탐사선과 잡종 배아
- 파고 및 FITC 결합 프로브 합성은 부록에 설명되어 있습니다. 강한 신호를 줄 것으로 예상 프로브, FITC 함유 세포핵과 synhesized되어야하며 약한 프로브 발굴 함유 세포핵과 함께 합성한다.
- 2 ML의 약병을 사용하여 하이브 리다이 제이션 버퍼 Prewarm 프로브 (500 NG / ML 각). 즉시 프로브 솔루션 하이브 리다이 제이션 버퍼를 교체하십시오. 배아는 건조시키지 마십시오. 65 16 시간을위한 품어 ° C.
- 하이브리드화 버퍼, 2 세척, 30 MN 65 ° C.와 각각의 프로브를 교체 65 (1 / 1 V / V /) 하이브리드화 버퍼 / MABT 15 MN 와시 ° C.
4 부 : 발굴 항체 보육 및 색상 반응
- MABT에서 2x20 MN 씻으십시오. 2퍼센트 BBR / MABT 1 시간 씻으십시오. 2퍼센트에 5 시간을 씻어 BBR/20 % 히스 / MABT (버퍼를 차단). 차단 버퍼 희석 1:2000 파다 항체에 품어, 4 O / N ° nutator에 C.
- MABT에서 배 10 미네소타 각각하고, 배 1 시간 MABT 각 씻으십시오.
- NTMT에서 배 20 MN 씻으십시오. 10 ML의 NTMT에 200ul의 NBT / BCIP 기판을 추가합니다. 즉시 병을에서 NTMT를 제거하고 1-2 ML NBT / BCIP 버퍼로 바꿉니다. 어둠 속에 넣습니다. 20 MN 후 색상 반응을 모니터링, 20 MN의 간격으로 그 이후.
- 색상 반응 (블루 나타납니다)에 따라, 10 MN을 위해 PBS에 세척 PBS로 가득 고정 접시에 아래 핀, 및 PBS의 4% PFA와 솔루션을 바꿉니다. 4 O / N ° C를 수정
- 새로운 섬광 유리병에 전송. 2x10 MN (1 % 트윈 - 20와 함께 PBS) PBST로 씻으십시오. MABT 2X 10 MN에 씻으십시오.
- 63 ° C.에 MABT 30 MN의 부화
제 5 부 : FITC 항체 보육 및 색상 반응
- MABT에서 배 10 미네소타, 2 %에 1 시간을 씻어 BBR / MABT, 차단 버퍼에 5 시간
- 알칼리성 인산 가수 분해 효소 - 결합 백신 FITC - 항체 (1:500) 4 O / N ° C.에 품어
- MABT에서 배 10 미네소타 각각하고, 배 1 시간 MABT 각 씻으십시오.
- 0.1 % 트윈 - 20 (TBST)으로 TBS 산도 8.45에서 배 20 MN에 씻으십시오.
- TBST이 키트에서 제공하는 시약 1,2와 3를 사용하여 벡터 레드 작업 솔루션 (5 ML)를 준비합니다. 즉시 병을에서 TBST를 제거하고 벡터 레드 버퍼로 바꿉니다. 어둠 속에 넣습니다. 40 MN 후 색 반응, 그리고 이후 30 MN의 간격을 모니터링합니다.
- 다음 색 반응 (적색 나타납니다), PBS로 전송 배아.
6 부 : 고정 및 처리
- PBS를 포함하는 고정 접시에 전송하고, 4 RT 또는 O / N 20 MN에 대한 4퍼센트 PFA의 해결 ° C.
- PBS, 2X 10 MN에 씻으십시오. 사진에 대한 처리하기 위해 PBS에 20 % 글리세롤 (이것은 태아가 반투명하게됩니다)을 전송할 수 있습니다. 챔버를 만들려면 슬라이드에 그들을 입력해, PVC 테이프 2 스트립 잘라. 블레이드를 사용하여 중앙에 사각형을 잘라 버릴거야. 광장 사용 포셉를 제거합니다.
- 왁스 sectioning에 대한 처리하기 위해 메탄올의 등급 시리즈 (25 %, 50 %, 75 % 및 PBS 100 %, 10 MN 각)에서 탈수, PBS, 씻지 2X 10 MN로 다시 전송할 수 있습니다.
- 프로파놀, 3mn로 바꿉니다. 1,2,3,4 - tetrahydronaphthalene로 교체, 20 MN은 Histoclear (2X 1 시간)으로 따라갔다. 1 시간에 대한 histoclear / 왁스 1분의 1 (V / V) 60 ° C로 바꿉니다. 왁스 처리로 교체조직학하십시오.
7 부 : 솔루션
-20에서 하이브 리다이 제이션 버퍼 저장 ° 팔콘에서 C, 50 ML : 25 ML의 포름 아미드, 3.25 ML (20xSSC), 0.5 ML (0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 1 ML (10 % 트윈 - 20), 2.5 ML (1 % SDS) ; 125 UL (20mg/ml tRNA). 100ul (50 MG / ML 헤파린) MABT는 100mM maleic 산성을 준비, 산도 7.5 NaOH 알약과 함께. 150mM NaCl 및 0.1 % 트윈 - 20을 추가합니다.
NTMT (사용 직전 만든), 50 ML : 1ml (5M NaCl), 2.5 ML (2M 트리스 - HCL pH9.5), 1.25 ML (2M MgCl 2), 5 ML (10 % 트윈 - 20).
TBST : 0.1M 트리스 - HCL, 0.15M NaCl, 산도 8.45, 0.1 % 트윈 - 20.
8 부 : 문제 해결
| 문제 | 원인 | 치료제 |
|---|---|---|
| 태아가 웅크리고있다 | 부족 탈수 / rehydration | 연속 탈수 / rehydration 단계 동안 10 MN 간격을 유지 |
| 프로브 신호가 없습니다 | 프로브는 병에 강등 RNase 오염입니다 | 전체 유리병이 2 단계에서 Proteinase K 용액에 노출되었는지 확인합니다 1퍼센트 아가로 오스 겔에 프로브를 실행 |
| 프로브 마음 레이블 충치 신경 튜브입니다 | 프로브가 갇혀있어 | 2 단계에서는 모든 충치가 뇌를 사용 microdissection 나이프 있는지 확인하거나 microcapillary |
| 배아는 다음과 하이브리드화 (3 단계)를 분해 | Proteinase K 단계가 너무 깁니다 하이브 리다이 제이션 온도가 너무 높습니다 왼쪽 | Proteinase K은 2 MN (단계 5-7), 3 MN (80-10 단계), 4 MN가 (11-13 단계), (단계 3 + 4) 이상 1mn보다 왼쪽해서는 안됩니다 높은 T O에 잡종을하지 마십시오 65 O C 이상 |
파트 9 : 대표 결과
대표 배아은 아래와 같습니다 : (A) 엠브료 (무대 HH7)이 파다 - 삭스 프로브 (파란색)와 FITC - 델타 - 1 프로브 (적색)으로 표시됩니다. (B) 엠브료 (무대 HH8)이 파다 - Pax6 프로브 (파란색)와 FITC - 쉬 프로브 (적색)으로 표시됩니다. NF, 신경 폴드, ANP, 앞쪽에 신경 판, PSM, presomitic mesoderm, N, notochord, NT, 신경 튜브). DRS의 실험실에서 프로브 선물. C. Tabin, M. 굴딩스, D. 헨리크, 그리고 J. 브리 스코. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
현장 하이브리드화 방식의 2 색 전체 마운트는 관심 중 하나 또는 두 개의 유전자를 사용하여 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴 모두를 결정하는 데 사용됩니다. 응용 프로그램은 새로운 유전자의 유전자 발현 패턴의 평가 (예 : 1,2,뿐만 아니라 유전자 발현 다음과 모욕의 변화 (배아 조작 3, 구슬 4 및 RNA 또는 DNA의 electroporation 5 구성)을 포함합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
