Summary
Здесь мы показываем, способ индуцирования и записи хода замедленного типа, гиперчувствительность (DTH) реакции у крыс уха. Это сопровождается демонстрацией подготовки крысы ткани уха в течение двух-фотонной визуализации эффектор / память ответа Т-клеток.
Abstract
Замедленного типа гиперчувствительности (DTH) является иммунная реакция, в которой основными игроками являются CCR7 - эффектор / память Т-лимфоцитов. Здесь мы демонстрируем метод для стимулирования и записи хода DTH реакцию у крыс уха. Это сопровождается демонстрацией подготовки крысы ткани уха в течение двух-фотонной визуализации CCR7 - эффектор / память ответа Т-клеток.
Приемные DTH индуцирована при введении препарата в GFP-меченых Ova конкретных CCR7 - эффектор / память линии Т-клеток (Битон, С J. Визуализированные Эксперименты, выпуск 8). Затем клетки позволили, чтобы уравновесить у крыс в течение 48 часов до заражения путем введения одного уха физиологическим раствором (контроль уха), а другая с 1:01 смесь яиц и Ova сопряженных в Техас-красный (Ова-TR), чтобы позволить визуализации резидентов антиген-представляющих клеток.
Мы опишем метод подготовки ткани полезны для работы с изображениями подвижность клеток в глубокие слой кожи во время иммунного ответа, в сочетании с визуализацией коллагеновых волокон путем генерации второй гармоники. Ухо ткань разрезают на 5 х 5 мм квадраты (немного больше, тем лучше) и монтируются на пластиковые скользит покрова с использованием Vetbond ™, которые затем крепится с помощью силиконовой смазки в камеру изображения и superfused кислородом-пузырилась культуральной среде ткани при температуре 37 ° C .
Protocol
Индукция приемных DTH
Пожалуйста, смотрите Юпитера статье: индукция и мониторинг приемных гиперчувствительности замедленного типа у крыс
Кристина Битон, Джордж К. Chandy
Кафедры физиологии и биофизики университета Калифорнии в Ирвине
Дж. Визуализированные Эксперименты, выпуск 8
Здесь мы изменили этому протоколу с помощью антигена (Овальбумин) сопряженных в Техас-красный в пропорции 1:1 с немеченого антигена для обеспечения визуализации фагоцитарной антиген-представляющих клеток.
Урожай уха ткани
- Усыпить крысу в заданное время точки по процедурам, изложенным в Вашем утвержденным животных протокола. Здесь мы используем передозировка анестетика, изофлуран. Это делается в закрытом контейнере находится внутри хорошо вентилируемом капот. Обеспечить животное мертво либо обезглавливание, открыв грудную полость и режущие сердца.
- Используя большие ножницы удалить ухо с одной вырезать, как можно ближе к телу животного, насколько возможно (рис. 1).
Рисунок 1. Удаление крысы ухо - Место ухо в 15 мл коническую трубку с ~ 10 мл ледяной 1x PBS или RPMI-1640. Храните образцы ткани на льду, пока вы не готовы подготовить ткань для работы с изображениями.
- Изображение ткань как можно скорее, мы находим, однако, что с 1 по 2 часа на льду не имеет заметного влияния на клеточной подвижности в тканях по сравнению с тканью собирают и отображаемого сразу.
Подготовка тканей для работы с изображениями
I. Удаление эпидермального и дермального слоя
* Примечание: глубокий слой кожи должны быть сохранены. Если все сделано правильно крупные кровеносные сосуды остаются неповрежденными и хряща уха не будет подвергаться. Это сложная техника, особенно, когда нет воспаления (контроль условий), и это полезно использовать рассекает микроскопом.
- Положите обе ткани и средств массовой информации из конической трубе в 10 см блюдо культуры ткани.
- С руками в перчатках держать ухо крысы мягко на кончике уха (дистальных) с дорсальной стороне уха вверх (рис. 2).
Рисунок 2. Trim мех ухо - С большой палец на верхнюю часть уха, устойчивые ткани при использовании кончика закрытой Дюмон # 5 ножницы, чтобы отделить от дермы глубокие слои дермы. Или же, если край уха навеса кожи / глубокие слои дермы, это может быть понято пинцетом и аккуратно вытащил отделить это от ткани снизу (рис. 3).
Рисунок 3. Удаление верхней дермы - После небольшой участок кожи был отделен от основной ткани, повторите шаги разделения альтернативно с помощью ножниц резать между кожных слоев и щипцы, чтобы аккуратно удалить и шелушиться кожа выбили.
- Expose 5 х 5 мм и более области уха ткани, которая составляет не менее 3 мм от начальной сайт антигена инъекции (рис. 4).
Рисунок 4. Ткань подвергается для работы с изображениями
II. Обеспечение тканей для изображений этап
- Вырезать пластического скольжения корки до размера чуть больше, чем готов ткани.
- Нанесите тонкий слой 3M ™ Vetbond ткани безопасный клей по слайду.
- Возьмитесь углу подготовлены ткани (где вы, вероятно, не образ), удалите из средств массовой информации, и приложите нижней ткани на бумаге линзы или Ким стереть, чтобы удалить излишки средства массовой информации.
- Сенсорный край ткани, чтобы клей покрыты слайд (Vetbond лечит сразу на мокрой ткани). Слегка растянуть ткань плоские, с противоположного конца будучи Последним, кто коснулся слайд (рис. 5)
Рисунок 5. Горы ткани для покрытия скольжения - Cure Vetbond ™ обращением образец ткани / слайдов и макая ее в резервуар носителей, таких, что ткани и слайде лицом вниз, и примерно на 45 градусов. Холдинг ткани с ног на голову под углом помогает предотвратить лишний клей от лечения на открытой поверхности ткани. Клей на поверхность ткани будет блокировать лазера (рис. 6).
Рисунок 6. Cure vetbond ткани Gluэлектронной путем погружения в средствах массовой информации
Примечание: Шаги 2-5 может занять немного практики для освоения. Попробуйте тренироваться с отбрасываются или дополнительных частей ткани, прежде чем в первый раз. - Нанесите небольшое количество силиконовой смазки на нижней части слайда.
- Место слайда в перфузионной камере. Убедитесь, что перфузия СМИ течет, 37 ° С и кислородом перед добавлением ткани. Осторожно надавите на края слайда сделать печать с силиконовой смазки между дном перфузии камеры и пластического скольжения покрытия.
III. Два-Фотон изображений
- Использование светлого поля проходящего света, сосредоточьтесь на верхней части ткани. Выключите все огни.
- Включите лазер, ФЭУ, как того требует ваш многофотонной микроскопии системы.
- Генерация второй гармоники (ГВГ) в сильно упорядоченное белки волокнистых (коллаген и миозина) выдает сигнал на половину длины волны лазерного возбуждения. Мы используем возбуждение при 900 нм, что приводит к генерации второй гармоники на длине волны 450 нм, которые могут быть визуализированы с помощью "синего" канала микроскопа. ГВГ поколение нелинейные (двухфотонного) процесс, и таким образом обеспечивает оптическое "срезов" Эффект похож на двухфотонного возбуждения флуоресценции. Максимальной эффективности ГВГ происходит, когда фибриллы перпендикулярно лазер, в то время как фибриллы, которые работают параллельно не будут визуализированы 1.
- Найдите хорошего области изображения с большим количеством ячеек, установите приобретения области, такие, что большинство клеток находятся в центре и начать съемки. Примечание: В DTH реакции, Т-клетки и другие инфильтраты клетка часто встречаются, чтобы быть сконцентрированы вместе, пока другие районы лишены проникают клетки 2. Таким образом, это может занять некоторое время на поиск ткани, чтобы найти лучшее место для изображения.
- Проверка жизнеспособности клеток путем оценки скорости клеток и полярность во время съемки. Используйте низкую мощность лазера, который обеспечивает приемлемое качество изображения для обеспечения минимального фото-повреждения.
- Замена в новый препарат ткани по мере необходимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
- Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
- Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
- Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. , In Press (2008).
