Summary
Burada uyaran ve sıçan kulak gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) reaksiyon ilerleme kaydetmek için bir yöntem gösteriyor. Bu sıçan kulak doku hazırlanması / bellek efektör T hücre yanıtının iki foton görüntüleme için bir gösteri izledi.
Abstract
Efektör / bellek T lenfositleri - Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH), ana oyuncuları CCR7 olan bir bağışıklık reaksiyonu . Burada, uyaran ve sıçan kulakta bir DTH reaksiyon ilerleme kaydetmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Efektör / bellek T hücre yanıtı - Bu sıçan kulak doku hazırlanması CCR7 iki foton görüntüleme için bir gösteri izledi.
Efektör / bellek T hücre hattı (Beeton, C J. görüntülenmiştir deneyler, Sayı: 8) - Bir evlat edinen DTH GFP etiketli Ova özel CCR7 intraperitoneal enjeksiyonu ile indüklenen. Hücreler daha sonra 48 saat önce meydan görselleştirme izin Texas-Kırmızı Ova ve Ova konjuge 1:1 karışımlar (Ova-TR) ile serum fizyolojik (kontrol kulak) ve diğer bir kulak enjekte sıçan denge sağlaması için izin verilir yerleşik antijen-sunan hücreler.
Biz bir görüntüleme motilite bir immün yanıt sırasında, ikinci harmonik üretimi, kolajen liflerinin görselleştirme ile birlikte derin dermal tabaka içinde hücreler için yararlı doku hazırlanması yöntemi açıklanmaktadır. Kulak doku 5 x 5 mm kareler (biraz daha büyük daha iyidir) oyulmuş ve sonra 37 görüntüleme odasında silikon gres kullanılarak güvenli ve oksijen kabarmış doku kültürü ortamı superfused Vetbond ™ kullanarak plastik kapak bordroları monte ° C .
Protocol
Kabul edilmiş DTH indüksiyonu
İndüksiyon ve İzleme Lütfen vallahi makalesine bakın: Sıçanlarda Kabul edilmiş Gecikmeli-Tipi aşırı duyarlılık
Christine Beeton George K. Chandy
Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü, University of California, Irvine
J. görüntülenmiştir Deneyler, Sayı 8
Burada, bu protokol fagositik antijen-sunan hücreler görünüm için izin etiketsiz antijen ile 1:1 oranında antijen (ovalbumin) Texas-Kırmızı konjuge kullanarak modifiye ettiler.
Kulak Doku Hasat
- İstediğiniz zaman noktada onaylanmış hayvan protokolde belirtilen usul ile sıçan Euthanize. Burada, aşırı dozda anestezi, izofluran kullanın. Bu, iyi havalandırılmış bir kaput içinde bulunan kapalı bir kap içinde yapılır. Hayvan torasik kavite açılması ve kalp kesim ya dekapitasyon ölü olduğundan emin olun.
- Büyük makas kullanarak hayvanın vücuduna mümkün olduğu kadar yakın tek bir kesim, (Şekil 1) kulak çıkarın.
Şekil 1. Rat kulak kaldırılması - Içeren bir buz 1x PBS veya RPMI-1640 ~ 10 ml 15 ml konik tüp kulak yerleştirin. Buz üzerinde doku örnekleri doku görüntüleme hazırlamak için hazır olana kadar tutun.
- Mümkün olduğunca çabuk Görüntü doku, hasat ve anında görüntülü doku göre 1 ila 2 saat buz üzerinde doku, hücre hareketi üzerinde belirgin bir etkisi olduğunu, ancak, bulabilirsiniz.
Görüntüleme için Doku Hazırlama
Epidermal ve dermal Katman I. Kaldırma
* Not: derin dermal tabaka sağlam tutulmalıdır. Eğer doğru yapılırsa büyük kan damarları kalacaktır ve kulak kıkırdak maruz kalmayacaktır. Herhangi bir inflamasyon (kontrol koşulları) var, özellikle bu zor bir tekniktir ve bir diseksiyon mikroskop kullanılması yararlı olur.
- 10 cm doku kültürü çanak konik tüp doku ve medya yerleştirin.
- Eldivenli eller, dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde (Şekil 2) kulak kulak (distal) ucuna hafifçe sıçan kulak tutun ile.
Şekil 2. Kulak keserek kürk - Kulak üst, derin dermis dermis ayrı ucu kapalı Dumont # 5 makas kullanırken sabit doku başparmak ile. Alternatif olarak, kulak kenarı deri / derin dermis bir çıkıntı varsa, bu forseps ile kavradı ve yavaşça altındaki doku (Şekil 3) ayrı çekti.
Şekil 3. Üst dermis kaldırılması - Bir kez cilt küçük bir alanda alternatif hafifçe kaldırın ve yerinden deri soyulabilir, dermal katmanlar ve forseps arasında kesmek için makas kullanarak ayırma adımları tekrarlayın, altta yatan doku ayrılmış oldu.
- 5 x 5 mm veya kulak doku antijen enjeksiyonu ilk site (Şekil 4) en az 3 mm daha geniş bir alana Açığa.
Şekil 4. Görüntüleme için maruz Doku
II. Görüntüleme Sahne Doku güvenliğini
- Plastik bir kapak kayma hazırlanan doku biraz daha büyük bir boyuta kesin.
- 3M Vetbond ™ slaytta doku güvenli yapıştırıcı ince bir tabaka halinde sürün.
- Hazırlanan doku (görüntü muhtemel değildir) köşesinde tutun, medya kaldırmak ve dab doku, lens kağıt veya Kym üzerinde alt aşırı medya kaldırmak için silin.
- Tutkal kapalı slayt (ıslak mendil hemen Vetbond kürleri) doku kenarına dokunun. (Şekil 5) slayt dokunmak için son olan diğer ucunu nazikçe, düz doku germek
Şekil 5. Kayma kapsayacak şekilde doku Dağı - Cure Vetbond ™ tersine doku örneği / slayt ve daldırma, doku ve slayt yüzü aşağı ve aşağı yukarı 45 derecelik bir açıda olduğu gibi medya bir rezervuar. Ters bir açıyla Holding doku maruz kalan doku yüzey kür fazla tutkal önlemek için yardımcı olur. Tutkal doku yüzeyine lazer engeller (Şekil 6).
Şekil 6. Vetbond doku glu CureMedyada daldırma e
Not: Adımlar 2-5 master için biraz pratik gerektirebilir. Ilk kez denemeden önce atılır veya ekstra doku parçaları ile pratik deneyin. - Dab üzerine silikon gres slayt altındaki küçük bir miktar.
- Perfüzyon odasında slayt yerleştirin. Perfüzyon medya, 37 ° C akan ve doku eklemeden önce oksijenli olduğundan emin olun. Perfüzyon odasının alt ve plastik kapak kayma arasında silikon gres yağı ile bir mühür slayt kenarlarını hafifçe bastırın.
III. İki-Foton Görüntüleme
- Parlak alan iletilen ışık kullanarak, doku üstüne odaklanır. Tüm ışıkları kapatın.
- Lazer açın, çok foton mikroskop sistemi tarafından gerekli Proje Yönetim Ekipleri.
- Ikinci harmonik üretimi, yüksek emretti lifli proteinler (SHG) (kolajen ve miyozin) ikaz lazer yarım dalga boyunda bir sinyal üretir. Mikroskop "mavi" kanalını kullanarak görüntülenebilmekte 450 nm'de SHG önde gelen 900 nM uyarma kullanın. SHG nesil bir non-lineer (iki-foton) işlemi ve bu nedenle floresan iki foton uyarma benzer bir optik "Kesit" etkisi sağlar. Paralel olarak çalışan fibriller görüntülenmiştir izin vermeyecek SHG tepe verimliliği, fibriller lazer dik oluşur. 1
- Bol hücre ile iyi bir görüntüleme alanı bulun hücrelerin çoğunluğunun merkezi ve görüntüleme başlar, satın alma alanı ayarlayın. Not: DTH reaksiyonlar, T hücreleri ve diğer hücre infiltrasyonlar sıklıkla, diğer alanlarda hücreler 2 infiltre yoksun ise birlikte konsantre olarak bulunmuştur . Bu nedenle, doku görüntü için en uygun alanı bulmak için arama biraz zaman alabilir.
- Görüntüleme sırasında hücre hızı ve polarite değerlendirerek hücre canlılığı için kontrol edin. Minimal fotoğraf zarar görmesini sağlamak için kabul edilebilir bir görüntü kalitesi sağlayan en düşük lazer gücü kullanın.
- Yeni bir doku hazırlanması gerektiği gibi değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
- Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
- Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
- Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. , In Press (2008).
