Isolement des noyaux neuronaux à partir de tissus post-mortem du cerveau de l'homme

Summary

L'hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante pour l'étude des marqueurs épigénétiques de la chromatine, car la plupart des essais n'ont pas la résolution seule cellule. Les neurones sont généralement mêlés à des cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Nous fournissons un protocole pour extraire et collecter des noyaux des neurones du cerveau humain.

Abstract

Les neurones dans le cerveau humain devient postmitotiques largement au cours du développement prénatal, et donc de maintenir leurs noyaux à travers la pleine durée de vie. Cependant, on sait peu de changements dans la chromatine neuronale et l'organisation nucléaire au cours du développement et de vieillissement, ou dans la maladie neuropsychiatrique chronique. Toutefois, à ce jour la plupart des dosages d'ADN de la chromatine et basée (autres que les poissons) la résolution de cellules manquent unique. À cette fin, l'hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante, parce que les sous-populations différentes de neurones normalement sont mêlés à différents types de cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Une solution possible serait de développer un type de cellule cultures spécifiques, mais la plupart des cellules du SNC, y compris les neurones, sont ex vivo durable, au mieux, pour seulement quelques semaines et ne serait donc fournir un modèle incomplet pour des mécanismes épigénétiques pourraient exploitation à travers la pleine durée de vie . Ici, nous fournissons un protocole pour extraire et purifier les noyaux de surgelés (jamais fixe) du cerveau post-mortem humain. La méthode consiste à l'extraction de noyaux dans un tampon de lyse hypotonique, suivie par ultracentrifugation et immunotagging avec des anti-NeuN anticorps. Étiqueté noyaux des neurones sont ensuite collectés séparément en utilisant la fluorescence-activated tri. Cette méthode devrait être applicable à n'importe quelle région du cerveau dans une large gamme d'espèces et propice aux études d'immunoprécipitation de chromatine avec des sites et la modification spécifique des anticorps anti-histones et la méthylation de l'ADN et autres tests.

Protocol

Extraction des noyaux

1. Mettez 250 mg de tissus post-mortem du cerveau congelé dans 5 mL ¹ Lysis Buffer dans un douncer et le placer sur la glace. Pour recevoir environ 5 millions de noyaux après la FACS tri, nous utilisons habituellement 1000 mg de tissu par exemple.
2. Une fois le tissu a été décongelé, le tissu Dounce pendant 1 minute tout sur la glace.
3. Prenez le tissu homogénéisé et le placer dans un tube de 15 ml ultracentrifugeuse clair. Placer le tube sur la glace.
4. Prenez 9 ml de ² Solution Sucrée avec une pipette, mettre la pipette au fond du tube d'ultracentrifugation clair, et la libération de la Solution ² Saccharose de créer un gradient de concentration avec la solution de tissu homogénéisé sur le dessus de la Solution ² saccharose.
5. Peser les tubes d'ultracentrifugation pour s'assurer qu'ils seront tous équilibrée tout en tournant dans le ultracentrifugation. Faites les ajustements à la masse en ajoutant ¹ tampon de lyse de la couche supérieure.
6. Après les tubes ont été pesés, les placer dans des seaux du rotor.
7. Placez tous les godets dans un rotor SW28 et placer soigneusement le rotor dans le ultracentrifugation.
8. Ultracentrifuger les échantillons à 107163,6 RCF pendant 2,5 heures à 4 ° C.
9. Une fois la centrifugation est terminée, retirez le surnageant, le long de la couche de débris trouvés au gradient de concentration, avec l'utilisation d'un vide, tout en faisant attention à ne pas perturber le culot contenant les noyaux au fond du tube.
10. Ajouter 500 ul de PBS 1X à chaque pastille et laisser reposer sur la glace pendant 20 minutes. Cela permet à la pastille à dissoudre un peu sur ses propres, ce qui rend plus facile à plus tard, mécaniquement dissoudre par aspiration et refoulement, ce qui diminue la quantité de stress de l'expérience des noyaux.
11. Après les noyaux ont incubé sur la glace pendant 20 minutes, mécaniquement pipette haut et en bas afin de dissoudre complètement les noyaux au sein 1XPBS.
12. Retirer la solution noyaux contenant des tubes d'ultracentrifugation et de combiner le contenu de deux tubes en un seul tube de 2 ml microtubes. Encore une fois, placer les échantillons sur la glace.

Immunocoloration pour FACS

1. À ce stade, faire un mélange composé immunomarquage de l'anticorps primaire et secondaire, et le blocage Mix. Pour chaque échantillon, mélanger 300 pi de 1XPBS contenant 1,2 uL d'anticorps NeuN, 100 ul de Mix de blocage, qui contient 0,5% de BSA et 10% sérum de chèvre normal dans 1XPBS, et 1 ul de Alexa Fluor 488. Pour les échantillons de contrôle, d'exclure l'NeuN anticorps primaire et, au contraire, il suffit d'ajouter 1XPBS.
2. Vortex le mélange immunomarquage et incuber pendant 5 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
3. Pendant que le mélange de coloration est en incubation, rendre les contrôles pour les échantillons. Pour FACS de tri, un échantillon contenant des noyaux seul, appelé le «contrôle sans tache» est nécessaire, un deuxième échantillon, un contrôle négatif, contenant des noyaux avec l'anticorps secondaire Alexa Fluor 488 sans NeuN anticorps primaire est également nécessaire.
4. Aliquote de 20 uL des noyaux contenant une solution dans un tube à centrifuger 2 ml contenant 1XPBS pour le contrôle sans tache, et un autre 20 uL dans un autre tube de 2 ml contenant 980 ul de 1XPBS pour le contrôle négatif. Augmentez le volume de l'échantillon contenant des noyaux de retour jusqu'à 1 mL avec 1XPBS. Tous les échantillons sont placés dos à la glace.
5. Maintenant que le mélange immunomarquage a terminé l'incubation, ajouter son contenu de 401 uL dans les échantillons appropriés. L'échantillon noyaux recevront le mélange contenant les deux NeuN et Alexa Fluor 488, tandis que l'échantillon négatif recevront le mélange ne contenant l'anticorps secondaire Alexa Fluor 488.
6. Prélever les échantillons dans la chambre froide pour tourner dans l'obscurité pendant 45 minutes.
7. Après les échantillons ont incubé dans l'obscurité pendant 45 minutes, les mettre sur la glace et les amener à l'installation de FACS. Pendant le transport à l'installation de FACS, les échantillons doivent être conservés sur la glace et dans l'obscurité.

FACS

1. À l'installation FACS, filtrer les échantillons à travers un filtre 40 um. Ensuite, les faire fonctionner grâce à l'instrument pendant quelques minutes, tout en étant conservés au froid, afin d'obtenir certaines données préliminaires avant le tri.
2. À ce stade, il est nécessaire de mettre les portes appropriées requises pour le tri. Plusieurs portes sont utilisés pour des échantillons de tri. La première porte donne une idée de la taille des différents noyaux trouvés dans l'échantillon, et permet separatation des débris de noyaux réels. La deuxième porte nous permet de trier les noyaux individuellement. Jeter tout agrégats sont rejetées à ce stade. Enfin, la troisième porte est fixé à une longueur d'onde spécifique de fluorescence, correspondant à celle du fluorochrome trouve dans nos anticorps secondaire. Placer cette porte nous permet de trier et de + NeuN séparées, donc les noyaux des neurones à partir NeuN - noyaux.
3. Après toutes les portes sont choisis, les noyaux peuvent être classés en 1XPBS.
4. Une fois leensemble de l'échantillon a traversé, vérifier la pureté de la sorte en exécutant une aliquote de l'échantillon trié à travers l'instrument. Assurez-vous que la fluorescence de l'échantillon n'est pas étalé, mais plutôt est contenue dans un seul quadrant. Il est préférable de choisir des échantillons qui sont plus de 90% pur.

Après FACS

1. Une fois l'échantillon a été trié, le traitement des noyaux peut commencer. Prélever 10 ml de l'échantillon trié et y ajouter 2 mL de ² Solution Sucrée, 50 ul de CaCl ₂ 1M et 30 ul de 1m Mg (Ace) _2. Pour rappel, toujours être sûr de garder l'échantillon sur la glace depuis les noyaux sont non fixées.
2. S'il ya moins de 10 mL d'échantillon trié, augmenter le volume jusqu'à 10 ml en ajoutant 1XPBS, ou ajuster le matériel supplémentaire en conséquence.
3. Inverser l'échantillon plusieurs fois et placer sur la glace pendant 15 minutes.
4. Après les échantillons ont incubé sur la glace pendant 15 minutes, les centrifugeuses dans un rotor à godets balancer à 1786 RCF pendant 15 minutes à ⁴ ° C.
5. Jeter le surnageant à l'utilisation d'un vide, sans perturber le culot blanc trouvé au fond du tube.
6. Dissoudre le culot dans 200 pi de toute solution dont vous avez besoin pour les expériences de procédure, et la pipette de haut en bas.
7. Transférer la solution dans un petit tube et le placer dans le congélateur à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

Discussion

Le protocole présenté ici devrait être particulièrement utile pour les études ont porté sur les modifications épigénétiques de la chromatine neuronale et, plus généralement, sur le phénotype moléculaire du noyau des neurones, au cours normal de la maladie neurologique ou psychiatrique en développement et le vieillissement, ou dans. La méthode est particulièrement avantageuse lorsque l'hétérogénéité cellulaire des tissus du cerveau, y compris d'éventuelles modifications dans le neurone-glie à la ration au cours du vieillissement ou à cause de la maladie sont une préoccupation ^1. Par exemple, en combinant le protocole de tri actuel des techniques d'immunoprécipitation de la chromatine, nous avons récemment décrit spécifique des neurones modèles de méthylation des histones au dérivé du cerveau neurotrophic promoteur du gène du facteur (BDNF), et pour d'autres gènes neuronaux ^2. Une méthode similaire avait été utilisé auparavant pour recueillir les neurones du cortex cérébral adulte pour la naissance datant rétrospective ^3. La technique de tri a également été employé dans de cerveau de souris ^2, et à cause de la stabilité des noyaux dans les surgelés-alors-décongelés tissus, nous prévoyons que l'approche présentée ici est applicable à un large éventail d'espèces. Parce immunoprécipitation de la chromatine d'aussi peu que 10 000 cellules est maintenant possible pour les même pour une couverture plus complète du génome ^4, il peut être possible d'utiliser beaucoup moins que les 1000 mg de matériau de départ que nous avions recommandé ci-dessus.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water