Summary
यहाँ, हम एक luciferase आधारित रिपोर्टर जीन Promega से दोहरे GloTM luciferase परख प्रणाली का उपयोग कर दृष्टिकोण के साथ phagocytosis प्रेरित जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन.
Abstract
यह झिल्ली biogenesis के दौरान अलग लिपिड संश्लेषण रास्ते के समन्वय का अध्ययन जहां झिल्ली biogenesis तेजी से और एक inducible तरीके से होता है एक प्रायोगिक प्रणाली के साथ काम करने के लिए उपयोगी है. हमने पाया है कि लेटेक्स मोतियों की phagocytosis इन प्रयोजनों के लिए व्यावहारिक है के रूप में कोशिकाओं के तेजी से झिल्ली लिपिड synthesize झिल्ली कण engulfment के दौरान सामग्री लपेटन के रूप में खो पूल भरने. यहाँ, हम एक luciferase आधारित रिपोर्टर जीन Promega से दोहरे Glo luciferase परख प्रणाली का उपयोग कर दृष्टिकोण के साथ phagocytosis प्रेरित जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन.
Protocol
सेल संस्कृति
- मानव भ्रूण 293 गुर्दे (HEK293) कोशिकाओं के स्टॉक संस्कृतियों 10-सेमी संस्कृति व्यंजन में 'मध्यम एक', है Dulbecco संशोधित है ईगल (DMEM) मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं के एक कॉकटेल (एक प्रकार की दवा की मिलीलीटर प्रति 100 इकाइयों और 100 μg के साथ पूरक के निर्वाचकगण में बड़े हो रहे हैं स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट के प्रति मिलीलीटर) और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS).
- एक प्रयोग के लिए कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए, मध्यम बंद चूसा है, और कोशिकाओं फॉस्फेट की 5 मिलीलीटर के साथ दो बार धोया जाता है नमकीन घोल (पीबीएस) buffered.
- पीबीएस और फिर हटा दिया जाता है एक 0.25% trypsin युक्त समाधान के 0.6 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित.
- पकवान ˚ 37 पर के बारे में 2 मिनट के लिए सी incubated है जब तक कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर दिया है.
- माध्यम की 5.5 मिलीलीटर trypsin बेअसर करने के लिए जोड़ा जाता है और कोशिकाओं hemocytometer के साथ गिना जाता है.
- कक्ष मिलीलीटर प्रति 320.000 कोशिकाओं को पतला कर रहे हैं और एक polylysine लेपित 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में अच्छी तरह से प्रति 0.1 मिलीग्राम पर तिरस्कृत.
- 37 पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में पकवान प्लेस ˚ सी एक 8.8% सीओ 2 से युक्त वातावरण के साथ और 24 घंटे के लिए बढ़ती.
Transfections
- Transfections के लिए तैयारी में, यह माना जा कितने प्रतिकृति प्रयोगात्मक शर्तों के अनुसार किया हो सकता है और क्या प्लाज्मिड की मात्रा ट्रांसफ़ेक्ट किया जाएगा रहे हैं चाहिए. हम नियमित रूप से तीन प्रतियों में सभी शर्तों के प्रदर्शन और अच्छी तरह से प्रति प्लास्मिड डीएनए के 50 से 100 एनजी का एक कुल transfect. प्लाज्मिड घोला जा सकता है शामिल होना चाहिए कम से कम एक संवाददाता जुगनू luciferase और एक नियंत्रण प्लाज्मिड व्यक्त विधान प्रमोटर से Renilla luciferase व्यक्त निर्माण.
- प्लाज्मिड समाधान 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में pipetted हैं और सीरम मुक्त और एंटीबायोटिक मुक्त DMEM के 10 μl नमूना प्रति के साथ पूरक है. उदाहरण के लिए, यदि 20 कुओं प्रत्येक 50 μg डीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हो रहे हैं, 1 μg डीएनए 200 μl DMEM जोड़ने.
- DMEM / डीएनए समाधान μg डीएनए प्रति 3 μl 'ट्रांजिट 293 अभिकर्मक (Mirus) जोड़ने के लिए. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स और कमरे के तापमान पर कम से कम 10 मिनट के लिए नमूने खड़े हो जाओ.
- इस अवधि के दौरान, 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से मीडिया को हटाने और ताजा मध्यम ए के 90 μl के साथ की जगह
- प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से DMEM / / डीएनए ट्रांजिट 293 मिश्रण के 10 μl जोड़ें.
- 37 पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में पकवान प्लेस ˚ सी एक 8.8% सीओ 2 से युक्त वातावरण के साथ और 24 घंटे के लिए बढ़ती.
Phagocytosis
- मध्यम बी प्लस (DMEM और हाम F12 के माध्यम से अधिक एंटीबायोटिक दवाओं और 10% FBS की एक 1:1 मिश्रण) 0.75 सुक्ष्ममापी मिलीलीटर प्रति शून्य से 1 मिलीग्राम पर लेटेक्स मोती युक्त निलंबन की तैयारी.
- 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से मीडिया निकालें और मध्यम बी में मनका निलंबन की 0.1 मिलीलीटर के साथ जगह
- 1000 x जी पर 2 मिनट के लिए थाली स्पिन
- कोशिकाओं तो 37 पर ˚ 6 से 16 बजे के लिए सी सुसंस्कृत हैं. शर्तों और ड्राइव luciferase, वृद्धि की रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति 1 से 3 बजे के बाद पता लगाया जा सकता है के लिए इस्तेमाल किया प्रमोटर पर निर्भर करता है.
- ही मामलों में यह 30 से 60 मिनट के लिए मोतियों के साथ कोशिकाओं को सेते हैं आवश्यक हो सकता है, तो पीबीएस के साथ 2 washes अनिगमित मोती निकालने के लिए, और जोड़ने के अतिरिक्त समय के लिए कोशिकाओं incubating से पहले ताजा मीडिया.
दोहरे GloTM luciferase परख
- नोट: इस किट का उपयोग करने के लिए हमारी प्रोटोकॉल निर्माता द्वारा सिफारिश की है कि से कुछ मामलों में अलग है. यह नमूना प्रति अभिकर्मकों की आवश्यकता की राशि को कम करने के लिए संशोधित किया गया है.
- -20 ˚ सी में कई छोटे aliquots और दुकान में 1 एम डीटीटी, डिवाइड के समाधान की तैयारी
- एक lysis बफर युक्त 20 मिमी Tris - एचसीएल (7.8 पीएच), 10% (v / v) ग्लिसरॉल, और 0.5% (v / v) Triton एक्स 100 तैयार. उपयोग करने के लिए पहले एक प्रयोग के लिए आवश्यक राशि विभाज्य और 0.5 के अंतिम एकाग्रता के लिए 1x 1 एम 1 डीटीटी अधिक protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के प्रति मिलीलीटर μl जोड़ने. बचे हुए डीटीटी समाधान पुनः प्रयोग मत करो.
- जब पहली बार के लिए दोहरी - GloTM किट का उपयोग कर, दोहरे GloTM luciferase सब्सट्रेट के एक बोतल (बशर्ते दोहरे GloTM luciferase बफर की एक बोतल (किट के साथ प्रदान की) की संपूर्ण सामग्री के हस्तांतरण (जुगनू) luciferase अभिकर्मक तैयार किट के साथ). -20 ˚ सी में 10 मिलीलीटर aliquots और दुकान में अप्रयुक्त luciferase अभिकर्मक फूट डालो
- टिशू कल्चर इनक्यूबेटर से 96 अच्छी तरह से थाली निकालें और बर्फ पर यह जगह. आकांक्षा द्वारा मीडिया निकालें, 40 μl प्रति के साथ lysis बफर जोड़ने के लिए, और फिर 30 मिनट के लिए बर्फ पर थाली छोड़.
- एक सफेद अपारदर्शी में 96 अच्छी तरह से थाली (OptiplateTM-96, Perkin एल्मर सूची संख्या 6005290) luciferase अभिकर्मक की अच्छी तरह से, और फिर प्रति विभाज्य 15 μl सेल lysate के 15 μl जोड़ें.
- 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं और फिर एक microplate रीडर में luminescence पढ़ें.
- तुरंत का उपयोग करने से पहले, भाग 1 दोहरी - GloTM बंद करो और Glo जोड़कर Renilla luciferase सब्सट्रेट समाधान का एक उचित मात्रा में तैयार ®अभिकर्मक (किट के साथ प्रदान की) 100 दोहरे GloTM बंद करो और Glo ® बफर (किट के साथ प्रदान की) भागों के लिए.
- अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 15 Renilla luciferase सब्सट्रेट समाधान के प्रति अच्छी तरह से μl, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते जोड़ने और फिर luminescence फिर से मापने के.
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