Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Summary

Hier beschreiben wir Verfahren für die Untersuchung von Veränderungen in Phagozytose-induzierte Genexpression mit einem Luciferase-basierten Reportergen-Ansatz mit dem Dual-GloTM Luciferase Assay System von Promega.

Abstract

Zur Untersuchung der Koordination der verschiedenen Lipid-Synthesewege in Membran-Biogenese ist es sinnvoll, mit einem experimentellen System, in dem Membran-Biogenese erfolgt schnell und in einem induzierbaren Weise zu arbeiten. Wir haben festgestellt, dass die Phagozytose von Latex-Beads praktisch für diese Zwecke als Zellen schnell synthetisieren Membranlipide zu Membran-Pools als Verpackungsmaterial während Partikel engulfment verloren aufzufüllen. Hier beschreiben wir Verfahren für die Untersuchung von Veränderungen in Phagozytose-induzierte Genexpression mit einem Luciferase-basierten Reportergen-Ansatz mit dem Dual-Glo Luciferase Assay System von Promega.

Protocol

Cell Culture

1. Stammkulturen von humanen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK293-Zellen) sind in 10-cm Kulturschalen in "Medium A ', bestehend aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit einem Cocktail von Antibiotika (100 Einheiten pro ml Penicillin und 100 ug ergänzt gewachsen pro ml Streptomycin-Sulfat) und 10% fötalem Rinderserum (FBS).
2. Zum Einrichten Zellen für ein Experiment, das Medium wird abgesaugt, und die Zellen werden zweimal mit 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Lösung.
3. Das PBS wird dann entfernt und durch 0,6 ml einer Lösung mit 0,25% Trypsin.
4. Das Gericht wird bei 37 ˚ C für ca. 2 min inkubiert, bis die Zellen begonnen haben, zu lösen.
5. 5,5 ml Medium A zugesetzt wird, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen mit einer Zählkammer gezählt.
6. Die Zellen werden auf 320.000 Zellen pro ml verdünnt und verzichtet auf 0,1 ml pro Vertiefung in einem Polylysin-beschichteten 96-well-Kulturplatte.
7. Setzen Sie die Schüssel in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ˚ C mit einer Atmosphäre, die 8,8% CO2 und wachsen für 24 Stunden.

Transfektionen

1. In Vorbereitung für Transfektionen, sollte überlegt werden, wie viele Wiederholungen sind pro experimentellen Bedingungen durchgeführt werden und welche Mengen von Plasmid wird transfiziert werden. Wir routinemäßig alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung und transfizieren insgesamt 50 bis 100 ng Plasmid-DNA pro Vertiefung. Plasmid vermischt sollte mindestens ein Reporter Ausdruck Glühwürmchenluciferase und eine Kontroll-Plasmid Ausdruck Renilla Luziferase aus einem konstitutiven Promotor-Konstrukts.
2. Plasmid-Lösungen sind in 1,5-ml Reaktionsgefäße pipettiert und ergänzt mit 10 ul pro Probe von Serum-freien und Antibiotika-freien DMEM. Zum Beispiel, wenn 20 Vertiefungen mit 50 ug DNA transfiziert werden, fügen Sie 200 ul DMEM auf 1 pg DNA.
3. Um das DMEM / DNA-Lösung add 3 ul 'Transit 293 Reagenz "(Mirus) pro pg DNA. Mix durch Pipettieren up & down und lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur stehen für mindestens 10 min.
4. Während dieser Zeit, entfernen Sie die Medien aus dem 96-Loch-Kulturplatte und ersetzen mit 90 ml frisches Medium A.
5. Zu jedem Well 10 ul der DMEM / DNA / Transit 293 Mischung.
6. Setzen Sie die Schüssel in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ˚ C mit einer Atmosphäre, die 8,8% CO2 und wachsen für 24 Stunden.

Phagozytose

1. Bereiten Suspensionen, die mittel-B (ein 1:1-Gemisch von DMEM und Hams F12-Medium plus Antibiotika und 10% FBS) plus 0,75-um Latexkügelchen auf Null zu 1 mg pro ml.
2. Entfernen Sie die Medien aus dem 96-Loch-Kulturplatte und ersetzen mit 0,1 ml Bead-Suspensionen in Medium B
3. Drehen Sie die Platte für 2 min bei 1000 x g.
4. Die Zellen werden dann bei 37 ˚ C für 6 bis 16 Stunden kultiviert. Abhängig von den Bedingungen und der Promotor verwendet werden, um Laufwerk Luciferase, erhöhte Expression des Reportergens nach 1 bis 3 Stunden nachgewiesen werden können.
5. In denselben Fällen kann es erforderlich sein, um die Zellen mit Perlen für 30-60 min inkubieren, dann 2 Wäschen mit PBS auf unincorporated Perlen zu entfernen, und fügen Sie neue Medien vor Inkubation der Zellen für zusätzliche Zeiträume.

Dual-GloTM Luciferase Assay

1. Hinweis: unser Protokoll für die Verwendung dieses Kit unterscheidet sich in einigen Punkten von dem vom Hersteller empfohlen. Es wurde geändert, um die Menge an Reagenzien pro Probe zu reduzieren.
2. Bereiten Sie eine Lösung von 1 M DTT, teilen sich in mehrere kleine Portionen und bei -20 ˚ C.
3. Bereiten Sie eine Lyse-Puffer mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) Glycerin und 0,5% (v / v) Triton X-100. Vor dem Gebrauch aliquoten Betrag für das Experiment benötigte und fügen Sie 1 ul pro ml von 1 M DTT und Protease-Inhibitor-Cocktail auf eine Endkonzentration von 0,5 bis 1x. Nicht wiederverwenden Überbleibsel DTT-Lösung.
4. Bei Verwendung der Dual-GloTM Kit zum ersten Mal, bereiten Sie die (firefly) Luciferase-Reagenz durch die Übertragung der gesamte Inhalt einer Flasche Dual-Luciferase GloTM Buffer (im Lieferumfang des Kits), um eine Flasche Dual-GloTM Luciferase Substrat (vorausgesetzt, mit dem Kit). Teilen Sie die unbenutzten Luciferase-Reagenz in 10-ml-Portionen und bei -20 ˚ C.
5. Entfernen Sie die 96-Well-Platte aus der Gewebekultur-Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie die Medien durch Aspiration, dann werden 40 ul pro Well Lysepuffer, und dann lassen Sie die Platte auf Eis für 30 min.
6. In einem weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platte (OptiplateTM-96, Perkin Elmer Bestellnummer 6005290) Aliquot 15 ul pro Well Luciferase Reagenz, und fügen Sie dann 15 ul Zelllysat.
7. Die Platte bei Raumtemperatur für 10 min und lesen Sie dann die Lumineszenz in einem Mikroplatten-Reader.
8. Unmittelbar vor dem Gebrauch vorbereiten eine entsprechende Menge an Renilla Luciferase-Substrat-Lösung durch Zugabe von 1 Teil Dual-GloTM Stop & Glo ®; Reagent (im Lieferumfang des Kits) und 100 Teile Dual-GloTM Stop & Glo ® Buffer (im Lieferumfang des Kits).
9. Zu jedem Well 15 ul pro Well der Renilla Luciferase-Substrat-Lösung bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren und messen Sie dann die Lumineszenz wieder.