Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Summary

Burada, Promega Çift GloTM Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Abstract

Membran biyogenezi sırasında farklı lipid sentez yollarının koordinasyon çalışma için, membran biyogenezi indüklenebilir bir şekilde ve hızla oluşan bir deneysel sistemi ile çalışmak için yararlıdır. Biz hücreler hızla parçacık engulfment sırasında malzeme sarma gibi kayıp membran havuzları doldurmak için membran lipidleri sentez olarak lateks boncuk fagositoz bu amaçlar için pratik olduğunu bulduk. Burada, Promega Dual-Glo Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Protocol

Hücre Kültürü

1. İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri Stok kültürler antibiyotik bir kokteyl (penisilin ml başına 100 birimleri ve 100 mikrogram ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı Orta (DMEM) oluşan 'orta A', 10-cm kültür yemekleri büyüdü. başına ml streptomisin sülfat) ve% 10 fetal sığır serumu (FBS).
2. Bir deney için hücreler kurmak için, orta emdi, ve hücreler 5 ml fosfat ile iki kez yıkanır tamponlu salin (PBS) çözümü.
3. PBS sonra kaldırılır ve 0.6 ml% 0.25 'lik tripsin içeren bir çözüm ile değiştirilir.
4. Hücreleri ayırmak başlamıştır kadar çanak 37 ˚ C'de yaklaşık 2 dakika süreyle inkübe edilir.
5. Tripsin nötralize etmek için 5.5 ml orta eklenir ve hücrelerin hemasitometre sayılır.
6. Hücreler ml'de 320.000 hücreleri için seyreltilmiş ve bir polylysine kaplı 96-kuyu kültür plaka başına 0.1 ml vazgeçtik.
7. 37 tabak doku kültürü inkübatör içine yerleştirin ° C% 8.8 CO2 içeren bir atmosfer ve 24 saat için büyümek.

Transfections

1. Transfections için hazırlanırken, deneysel koşullar başına yapılan ve plazmid miktarda transfekte olacak kaç çoğaltır düşünülmelidir. Biz rutin olarak üç nüsha halinde tüm koşulları yerine ve iyi plazmid DNA ortalama 50 ila 100 ng bir toplam transfect. Plazmid karışımları, en azından bir muhabir ateşböceği lusiferaz ve bir kurucu organizatörü kontrol plazmid ifade Renilla lusiferaz ifade inşa içermelidir.
2. Plazmid çözümler, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler pipetlenir ve serum ve antibiyotik DMEM örnek başına 10 ul ile desteklenebilir. 20 kuyu her 50 mg DNA ile transfekte Örneğin, 1 mg DNA 200 ul DMEM ekleyin.
3. DMEM / DNA çözüm mg DNA başına 3 ul 'Transit 293 reaktif' (Mirus) ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın ve numuneler oda sıcaklığında en az 10 dakika bekletin.
4. Bu dönemde, 96 kuyu kültür plaka medyayı çıkartın ve taze orta A. 90 ul ile değiştirin
5. Her biri 10 ul DMEM / DNA / Transit 293 karışımı ekleyin.
6. 37 tabak doku kültürü inkübatör içine yerleştirin ° C% 8.8 CO2 içeren bir atmosfer ve 24 saat için büyümek.

Fagositoz

1. Orta B artı (DMEM ve Ham F12 orta artı antibiyotik ve% 10 FBS bir 1:1 karışımı), ml başına sıfır 1 mg 0.75 mikron lateks boncuklar içeren süspansiyonlar hazırlayın.
2. 96-kuyu kültür plaka ortamı çıkarın ve orta B. boncuk süspansiyonlar 0.1 ml ile değiştirin
3. 1000 x g. az 2 dakika süreyle plaka Spin
4. Bu hücreler daha sonra 37 ˚ C'de 6 ila 16 saat için kültüre. Koşulları ve lucifeares, artan muhabiri gen ekspresyonu 1 ila 3 saat sonra tespit edilebilir sürmek için kullanılan promotor bağlı.
5. Aynı durumda bu hücrelerin 30 ila 60 dakika süreyle boncuklar ile inkübe için gerekli olabilir, daha sonra adi boncuk kaldırmak ve ek süre hücreleri kuluçka önce taze medya eklemek için PBS ile 2 yıkar.

Çift GloTM Lusiferaz Testi

1. Not: bu kit kullanımı için protokol üretici tarafından önerilen bazı bakımlardan farklıdır. Bu örnek başına gerekli reaktiflerin miktarını azaltmak için modifiye edilmiştir.
2. -20 ˚ C'de 1 M DTT, bölme, birden fazla küçük alikotları ve depoya bir çözüm hazırlayın
3. 20 mM Tris-HCl (pH 7.8),% 10 (v / v) gliserol ve% 0.5 (v / v) Triton X-100 içeren bir lizis tamponu hazırlayın. Kullanmadan önce, kısım, deney için gerekli bir miktar ve 1x 0.5 nihai konsantrasyonu 1 M DTT artı proteaz inhibitörü kokteyl ml başına 1 ul eklemek. Artık DTT çözümü yeniden etmeyin.
4. Çift GloTM kiti ilk kez kullanırken, bir şişe, Çift GloTM Lusiferaz Yüzey (sağlanan bir şişe Çift GloTM Lusiferaz Tampon (kit ile birlikte verilen) tüm içeriğini aktararak (ateşböceği) Lusiferaz Reaktif hazırlamak kiti ile). -20 ˚ C'de 10 ml alikotları ve depoya kullanılmayan Lusiferaz Reaktif Böl
5. 96-plaka doku kültürü inkübatör çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Aspirasyon medya çıkarın ul için de lizis tamponu 40 ekleyin ve sonra 30 dakika buz üzerinde plaka bırakın.
6. Lusiferaz Reaktif ve sonra, ortalama bir beyaz, opak 96 plaka (OptiplateTM-96, Perkin Elmer katalog sayısı 6.005.290) kısım 15 ul 15 ul hücre lizat ekleyin.
7. Plaka 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve sonra bir mikroplaka okuyucu lüminesans okuyun.
8. Kullanımdan hemen önce, 1 parçası Çift GloTM Durdur & Glo ekleyerek Renilla lusiferaz substrat çözeltisi uygun miktarda hazırlamak ®Reaktif (kit ile birlikte verilen), 100 parça Dual-GloTM Stop & Glo ® Tampon (kit ile birlikte verilen).
9. Her biri için 10 dakika oda sıcaklığında inkübe Renilla lusiferaz substrat çözeltisi 15 ul başına iyi, ekleyebilir ve daha sonra tekrar lüminesans ölçmek.