Studera Membran biogenes med en luciferas-Based Reporter Gene Assay

Summary

Här beskriver vi rutiner för att studera förändringar i fagocytos-inducerad genuttryck med en luciferas-baserad reporter gen metod att använda Dual-GloTM luciferas analyssystem från Promega.

Abstract

Att studera samordningen av olika vägar lipid syntes under membranet biogenes det är bra att arbeta med ett experimentellt system där membranet biogenes sker snabbt och på ett inducible sätt. Vi har funnit att fagocytos av latex pärlor är praktiskt för dessa ändamål som celler snabbt syntetisera membran lipider för att fylla på membran pooler förlorade emballeringsmaterial under partikel omvälvning. Här beskriver vi rutiner för att studera förändringar i fagocytos-inducerad genuttryck med en luciferas-baserad reporter gen metod att använda Dual-Glo luciferas analyssystem från Promega.

Protocol

Cell Culture

1. Stock kulturer med humana embryonala njur 293 (HEK293) celler odlas i 10-cm kultur rätter i "medium A", bestående av Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) kompletteras med en cocktail av antibiotika (100 enheter per ml penicillin och 100 mikrogram per ml streptomycin sulfat) och 10% fetalt bovint serum (FBS).
2. För att ställa in celler för ett experiment, är mediet sugs bort, och cellerna tvättas två gånger med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning.
3. PBS tas sedan bort och ersätts med 0,6 ml av en lösning som innehåller 0,25% trypsin.
4. Skålen är inkuberas vid 37 ˚ C i ca 2 min tills cellerna har börjat att lossa.
5. 5,5 ml av mediet A skall läggas för att neutralisera trypsin och cellerna räknas med en hemocytometer.
6. Celler späds till 320.000 celler per ml och doseras med 0,1 ml per brunn i en polylysine-belagd 96-bra kultur plattan.
7. Placera skålen i en vävnadsodling inkubator vid 37 ˚ C med en atmosfär som innehåller 8,8% CO2 och växa i 24 timmar.

Transfections

1. I förberedelserna för transfections, bör det övervägas hur många replikat som ska utföras per experimentella förhållanden och vilka mängder av plasmid kommer att transfekterades. Vi utför rutinmässigt alla villkor i tre exemplar och transfektera totalt 50 till 100 ng av plasmid-DNA per brunn. Plasmid blandar bör innehålla minst en reporter konstruera uttrycka eldfluga luciferas och en kontroll plasmid uttrycka Renilla luciferas från en konstitutiv promotor.
2. Plasmid lösningar pipetteras till 1,5 ml mikrocentrifugrör och kompletteras med 10 l per prov av serum-fria och antibiotika-fria DMEM. Till exempel, om 20 brunnar ska vardera transfererats med 50 mikrogram DNA, tillsätt 200 l DMEM till 1 mikrogram DNA.
3. Till DMEM / DNA-lösning tillsätts 3 l "transit 293 reagens (Mirus) per mikrogram DNA. Blanda genom att pipettera upp och ner och låt proverna stå i rumstemperatur i minst 10 min.
4. Under denna period, ta bort materialet från den 96-bra kultur plattan och ersätta med 90 l av färska medelstora A.
5. Till varje brunn Tillsätt 10 ìl av DMEM / DNA / Transit 293 blandning.
6. Placera skålen i en vävnadsodling inkubator vid 37 ˚ C med en atmosfär som innehåller 8,8% CO2 och växa i 24 timmar.

Fagocytos

1. Förbered innehållande medelstora B (en 1:1 blandning av DMEM och Hams F12 medelstora plus antibiotika och 10% FBS) plus 0,75-ìm latex pärlor på noll till 1 mg per ml.
2. Ta bort materialet från den 96-bra kultur plattan och ersätta med 0,1 ml pärla suspensioner i medelstora B.
3. Snurra plattan i 2 min vid 1000 x g.
4. Därefter är cellerna odlas vid 37 ˚ C i 6 till 16 timmar. Beroende på förutsättningar och initiativtagaren används för att driva luciferas ökade reporter genuttryck kan upptäckas efter 1 till 3 timmar.
5. I samma fall kan det vara nödvändigt att inkubera celler med pärlor i 30 till 60 minuter, gör sedan två tvättar med PBS för att ta bort oregistrerade pärlor och lägga till nya media innan inkubering av cellerna för ytterligare perioder.

Dual-GloTM luciferas-analys

1. OBS: våra protokoll för att använda detta kit skiljer sig i vissa avseenden från det som rekommenderas av tillverkaren. Det har modifierats för att minska mängden reagens som behövs per prov.
2. Bered en lösning av 1 M DTT, dela upp i flera små portioner och förvara vid -20 ˚ C.
3. Förbered en lyseringsbuffert innehållande 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) glycerol och 0,5% (v / v) Triton X-100. Före användning, uppmätt ett belopp som behövs för experimentet och tillsätt 1 l per ml 1 M DTT plus proteashämmare cocktail till en slutlig koncentration av 0,5 till 1x. Återanvänd inte överblivna DTT lösningen.
4. När du använder dubbla GloTM kit för första gången, förbereda (Firefly) luciferas Reagent genom att överföra hela innehållet i en flaska med dubbla GloTM luciferas Buffer (medföljer kitet) till en flaska med dubbla GloTM luciferas Substrat (förutsatt med satsen). Dela oanvända luciferas reagens i 10-ml-portioner och förvara vid -20 ˚ C.
5. Ta bort 96-brunnar från vävnadsodling inkubatorn och placera den på is. Ta bort materialet genom aspiration, tillsätt 40 l per brunn lyseringsbuffert och sedan lämna tallriken på is i 30 min.
6. I en vit, ogenomskinlig 96-håls platta (OptiplateTM-96, Perkin Elmer katalognummer 6.005.290) alikvot 15 l per brunn av luciferas Reagens och sedan lägga till 15 l av cell lysat.
7. Inkubera plattan vid rumstemperatur i 10 min och sedan läsa luminiscens i en mikroplattor läsare.
8. Omedelbart före användning, förbereda en lämplig mängd Renilla luciferas substratlösning genom att tillsätta 1 del dubbla GloTM Stop & Glo ®; Reagent (medföljer kitet) till 100 delar Dual-GloTM Stop & Glo ® Buffer (medföljer kitet).
9. Till varje brunn Tillsätt 15 l per brunn av Renilla luciferas substratlösning, inkubera vid rumstemperatur i 10 min och sedan mäta luminiscens igen.