Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ett beteende analys för att mäta lyhördhet Zebrafish till förändringar i ljusintensiteter

doi: 10.3791/923 Published: October 3, 2008

Summary

Vi utvecklade Visual-Motor Svar kvantifiera motorn produktion av larver zebrafisk som svar på lätta steg och minskningar. Vi har även granskat zebrafisk visioner mutanterna, inklusive några optokinetic svar (NRC) mutanter, som var tänkt att vara helt blind när den testas av en annan syn analys, den optokinetic reflex.

Abstract

Den optokinetic reflex (okr) är en grundläggande visuell reflex ut av de flesta ryggradsdjur och spelar en viktig roll för att stabilisera ögat i förhållande till den visuella scenen. Kräver dock okr att ett djur upptäcka rörliga ränder och det är möjligt att fisk som inte uppvisar ett okr kanske inte är helt blind. En zebrafisk mutant, no optokinetic svar c (NRC) har ingen okr under några ljusförhållanden testade och rapporterades vara helt blind. Tidigare har vi visat att OFF-gangliecell aktivitet kan registreras i dessa mutanter. För att avgöra om mutant fisk utan okr som NRC mutanten kan upptäcka enkla lätta steg och Minskar vi utvecklat den visuella motoriska beteende analys (VMR). I denna analys, är ensamstående zebrafisk larver placeras i varje brunn på en 96-brunnar är möjligt att samtidigt övervaka larver med hjälp av en automatiserad video-tracking system. Den rörelseapparaten svar på varje larv till 30 minuter tända och 30 minuter lampan spelades in och kvantifieras. WT fisk har en kort spik i motorisk aktivitet vid ljus på, känd som reaktion på plötsliga ljud, följt av återgång till lägre än utgångsvärdet aktivitet, en så kallad frysning. WT fisk också kraftigt öka sin rörelseaktivitet omedelbart efter belysningen och endast gradvis (under flera minuter) återgår till utgångsläget rörelseaktivitet. NRC mutanter reagerar liknande till lampan som WT fisk, men uppvisar en liten minskning av deras genomsnittliga aktivitet jämfört med WT fisk. Motorisk aktivitet som svar på ljus ON i NRC mutanter är försenat och trög. Det är en långsam stigtid för NRC mutant reaktion på ljus PÅ jämfört med WT ljus PÅ svar. Resultaten tyder på att NEO fisk inte är helt blinda. Eftersom teleosts kan detektera ljus genom icke-retinal vävnader, bekräftade vi att den omedelbara beteendemässiga reaktioner på ljus intensitet förändringar kräver intakt ögon genom att använda chokh (CHK) mutanter, som helt saknar ögon från de tidigaste stadierna av utveckling. I vår VMR analysen av CHK mutanter uppvisar ingen reaktion vid oväntade yttre antingen ljus PÅ eller AV, visar att den laterala ögon förmedla detta beteende. I VMR-analysen som beskrivs här kompletterar de väletablerade okr assay, som inte testar förmåga zebrafisk larver att svara på förändringar i ljusintensiteter. Dessutom lånar automatisering av VMR analysens sig till high-throughput screening för fel i ljus-intensitet driven visuell svar.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll beskriver stegen för att utföra Visual-Motor Svar av zebrafisk larver till ljus ökningar och minskningar i ditt eget laboratorium. Zebrafisk är ett bra modellsystem för beteendestudier. De är lätta att underhålla, de har stor koppling storlekar och de utvecklas snabbt. Till exempel ögon zebrafisk larver är lyhörda för ljus dag 3 efter utveckling och då de uppvisar en reaktion på plötsliga ljud.

Del 1: Plätering enskilda fiskar till ett 96 brunnar

  1. Väx WT larver under en mörk / ljus cykel vid 28 ° C tills åtminstone 4 dagar efter befruktningen (DPF). Våra typiska ljus: mörker-cykel är 14 timmar av ljus på börjar vid 9:00, och 10 timmar av belysningen, med start klockan 11:00 PM. För bästa beteendemässiga resultat, undvika överbeläggning, vi brukar hålla högst 50 larver i en enda petriskål.
  2. Efter 4 DPF, den zebrafisk är redo att överföras till ett 96-brunnar. För att ge larverna mer simning rum, använder vi normalt en 96-brunnar med en stor bra storlek på 650 l, men standard 96-brunnar fungera alldeles utmärkt. Med hjälp av en plast överföring pipett försiktigt överföra en larv per brunn.
  3. Efter överföring fisk i brunnar, fyll varje brunn med tillräckligt mycket fisk vatten så att vattenytan är nästan spola till toppen av brunnarna. Antingen överfyllning eller underfilling brunnen kan orsaka optiska problem för inspelningen kameran. Också se till att inte införa bubblor i brunnarna.

Del 2: Kartläggning av apparater för ljudinspelning

För denna del av protokollet, se filmen för att identifiera komponenter och bekanta dig med vår inrättat av inspelningen apparaten.

  1. Inne i inspelningen kammaren är en väl definierad plats att placera 96-brunnar.
  2. Kameran är placerad i ryggen och är fokuserad på tallriken med speglar från rutan. Vinkeln på dessa speglar kan justeras genom att vrida skruvarna som håller speglarna på plats.
  3. Inspelningen kammaren är belyst från botten av infraröda lysdioder. Det gör att kameran för att se fisken även i mörker. Larverna kan inte detektera IR-ljus, så denna ständiga IR-belysning inte påverkar experimentet. Vita lysdioder lyser också inspelning kammaren underifrån. De styrs separat från IR-ljus. Lysande kammaren med vitt ljus uppifrån eller från sidorna är säkert möjligt, men i dessa fall måste försiktighet iakttas för att undvika starka glares från vattenytan som kan störa kameran.
  4. För experiment som varar längre än ett par timmar, fyll kammaren med långsamt rinnande vatten för att upprätthålla en konstant temperatur för den experimentella varaktighet. Ett sätt att åstadkomma ett konstant flöde av vatten är att pumpa vatten från en reservoar med ett litet akvarium pump som är uppvärmd till 28 ° med en typisk undervattens akvarium värmare.
  5. För att minimera herrelösa vibrationer från rummet, bör hela inspelningen enheten sitter på toppen av en tung balans bord.

Del 3: Anpassning av den 96-brunnar med datorn rutnät av video-spårning

Programvara

  1. Placera 96-brunnar innehåller fisken i inspelningen kammaren.
  2. När du använder ett vattenbad, långsamt placera plattan i vattnet, vilket ger vattennivån en chans att anpassa sig utan att spilla på plattan. Alternativt kan stänga av vattenflödet, lägg plåten, och sedan återuppta flödet. Var också noga med att använda en fjäder eller ett gummiband för att hålla 96-brunnar på plats.
  3. I Viewpoint Videotrack programvaran, kontrollera att alla larver av experimentets syns på datorskärmen. Med hjälp av kontroller av programvaran, anpassa nätet för video-mjukvara med brunnar din tallrik så att varje fisk är i en kvadrat med nätet. Spårning Datorn kommer att beräkna rörelsen separat för varje av dessa rutor, så om du snedställ datorn rutnät några av fiskarna rörelser kan gå förlorade. Eller ännu värre: två intilliggande fisk bor i samma område och räknas som en fisk. Detta steg är mycket viktigt för alla dina inspelningar.
  4. Efter justeringen, program tidpunkten för när ljuset ska gå på och av. Vi tillåter normalt 3 timmar av ljus eller mörk anpassning i rutan både för att få en nivå som baslinjen aktivitet, men också att ge ynglen en chans att lugna ner efter pipettering och hantering. Efter baslinjen, suppleant vi sedan med 30 minuters lampor på följt av 30 minuter av belysningen, och upprepa flera gånger.
  5. Nästa, stäng dörren av inspelningen kammare och börja spela in.
  6. I praktiken registrerar vi den aktivitet av varje fisk per sekund, men den Viewpoint mjukvaran i själva verket registrerar bildruta för bildruta data (se filmenför en demonstration av datainsamling). Inställning av tröskelvärde för minsta pixel förändring per ram beror lite på din kamera och ljus inställningar. För vår inställning, använder vi normalt en tröskel på 4 pixlar, dvs om färre än 4 pixlar förändras, anses det bakgrunden. Om fler än 4 pixlar går, betyder det att fisken rör sig. Vi bestäms empiriskt att denna cutoff känner nästan alla larver simma och rörelser tur.
  7. Även om inspelningen rutorna isolerar larverna ganska bra, stänga av ljuset i rummet och ta hand för att minimera avbrott med mekaniska ljud som att stänga och öppna dörrar i rummet, med en dans fest, eller gör din träning rutiner.

Del 4: att analysera data

  1. Efter experimentet är klar, överföra uppgifter som samlats in i ett Excel-ark eller till din favorit analys svit.
  2. Den bifogade Excel-ark är ett exempel på vad uppgifterna kan se ut: den innehåller tid i sekunder från start av experimentet och aktivitet av varje larv per sekund för alla fiskar under hela experimentet (se kompletterande datafil Exempel på Filer på den här sidan).

  3. Figur 1 visar ett exempel på aktivitet av en enda larv. Figur 2 är en representant spår av i genomsnitt 40 WT zebrafisk larver. I genomsnitt ON och OFF svar är framträdande och konsistenta.

    Figur 1

    Figur 1: av en enda fisk Aktiviteten hos en enda WT fisk på 5 DPF som svar på växlande perioder av 30 minuter ljus PÅ och AV.. Den på svar markeras med svarta pilar och OFF svaren med röda pilar.


    Figur 2
    Figur 2: Genomsnittliga aktivitet 40 fisk genomsnittliga aktivitet 40 WT fisk på 5 DPF som svar på växlande perioder av 30 minuter ljus PÅ och AV.. I genomsnitt ON (svarta pilar) och OFF (röda pilar) svar är framträdande och konsistenta.

5. Representativa resultat

Figur 3 är en schematisk beskrivning av de experimentella disposition som används i alla våra experiment.

Figur 3

Figur 3. Experimentell design av Visual Motor Response (VMR) test. A) enskilda fiskarna placeras i en 96-brunnar i en inspelning kammare. Aktiviteten av varje fisk mäts per sekund. B) Fisk är en tid på mörk eller ljus anpassning till lösa dem och få en nivå baslinjen aktivitet. Perioder av 30 minuter lampor på och lamporna införs i följd för sammanlagt 3 timmar. Detta diagram anpassades från Prober et al. 2006.

Vad Visual-Motor Response grafer se ut?

Vi mätte ON och OFF svar WT fisk till lätta steg och minskningar. För att bekräfta att dessa svar var beroende av ögats funktion, mätte vi aktiviteten av CHK mutanter, som inte utvecklar några ögon. Figur 4 visar den genomsnittliga aktiviteten från WT djur samt mutanter CHK.

Figur 4

Figur 4: WT fisk har tydliga ON och OFF svar som förmedlas av den laterala ögon rörelseorganen beteende zebrafisk larver vid 5 DPF som svar på 30 minuter av ljus på och 30 minuter av ljus OFF registreras per sekund.. Varje spår representerar ett genomsnitt på 480 svar från 120 enskilda WT (blå spår) eller CHK mutant larver (orange spår) noterats under tre experiment. Den CHK mutanter inte avsevärt öka sin aktivitet till antingen ljus ökar eller minskar och har en låg basnivå av aktivitet. Denna siffra var anpassade från Emran et al. 2007.

Visual-Motor Svaren från NRC mutant fisk.

NRC mutant ansågs vara helt blind baseras på okr testet. I NEO mutant, utgör den ljusmätare terminaler inte ordentligt och på visuella vägen är allvarligt äventyras 1. Retinal ganglion celler inspelningar från dessa muterade fiskar visade att de uppvisar övervägande OFF-typ svar ganglion celler, vissa onormala ON-OFF, men ingen ren On-typ svar 2.

Använda VMR testar vi visade att NRC mutant har en normal AV-respons och en försenad och trög ON-svar (see Figur 5). Således är NRC mutanten inte helt blind som man tidigare trott 2.

Figur 5
Figur 5: NEO mutats öka sin aktivitet till följd av förändringar i ljusintensiteter beteendemässiga reaktioner för ljus på och av från WT och NEO muterade larver vid 5 DPF.. Varje spår representerar ett genomsnitt på 480 svar från 120 enskilda fiskar från varje genotyp. Den genomsnittliga rörelseapparaten beteende NEO mutanter (rosa spår) är något lägre i jämförelse med WT fisk (blå spår) men är fortfarande kraftig efter lampan stimulans. Notera den långsamt stigande tiden i NRC mutant svar på ljus PÅ jämfört med ljuset på svar av WT fisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den experimentella procedurer vi visar i filmen är alla representativa för WT fisk. Dock kan dessa försök göras analogt på mutant fisk samt (se avsnitt representativt resultat). Vi föreslår till tallrik WT fisk och muterade fisk på samma tallrik i en Checker Board översikt för optimal kontroll.

När du använder mutant fisk på samma tallrik som WT fiskar se till att du skriver ner vilken typ av fisk var klädd i varje brunn. Här är ett förslag på hur man håller koll på fisken pläterade i varje brunn (Visa anteckningsbok med datablad).

Dessutom är det bäst att göra upprepningar av ett visst experiment vid samma tidpunkt på dagen. Till exempel, om du startar 3 timmar mörka anpassning för att få ett utgångsvärde aktivitet klockan 12 (middag), sedan upprepa samma experiment på samma gång för följande uppsättningar av data.

Dessutom gör de experiment under dagen som fisk är mer aktiva och lyhörda för ljusintensitet förändringar under dag jämfört med under natten.

Vi använde Videotrack mjukvaran i kvantiseringen läge från Viewpoint Lifesciences. Det finns dock andra comerically finns tracking-system, inklusive EthoVision från Noldus.Or, som andra labshave gjort, youcould designa din egen spårningsprogramvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institute of Health bidrag EY0081 och 5T32UY07145 och av Tempelherreorden Eye Foundation. Jason Rihel är en Bristol-Squibb Fellow Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Microplate devices Tool Whatman, GE Healthcare 7701-1651
Transfer pipetes Tool VWR international 202205
Fish water Reagent refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox) Tool Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software Tool Viewpoint Lifesciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
  2. Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
  3. Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
  4. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
Ett beteende analys för att mäta lyhördhet Zebrafish till förändringar i ljusintensiteter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities . J. Vis. Exp. (20), e923, doi:10.3791/923 (2008).More

Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities . J. Vis. Exp. (20), e923, doi:10.3791/923 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter