Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

Summary

Görsel-Motor Yanıt hafif artışlarla ve azaltır yanıt larva zebrafish motor çıkışını ölçmek için geliştirdi. Biz de dahil olmak üzere başka bir görme testi optokinetik refleks tarafından test edildiğinde tamamen kör olduğu düşünülüyordu optokinetik yanıt (NRC) mutantlar, hiçbir zebrafish vizyon mutant inceledi.

Abstract

Optokinetik refleks (okr) temel bir görme refleksi en omurgalılar tarafından sergilenen ve görsel sahne göreceli göz istikrara önemli bir rol oynar. Ancak okr, bir hayvan hareketli çizgiler tespit gerektirir ve bir okr sergi için başarısız balık tamamen kör olmayabilir mümkündür. Bir zebrafish mutant, hiçbir optokinetik yanıt c (NRC), herhangi bir ışık koşulları altında test edilmiş ve tamamen kör olduğu bildirildi hiçbir okr vardır. Daha önce, bu mutant OFF-ganglion hücre aktivitesi kaydedilebilir olduğunu göstermiştir. NRC mutant olarak hiçbir okr mutant balık, basit ışık artışlarla ve görsel motor davranış assay (VMR) geliştirdi azaltır tespit olup olmadığını belirlemek için. Bu testte, tek Zebra balığı larvaları otomatik bir video izleme sistemi kullanılarak larvaların eş zamanlı izleme sağlayan bir 96 plaka her kuyuda yerleştirilir. 30 dakika ve 30 dakika hafif OFF ışığı her larva lokomotor yanıtları kaydedildi ve ölçüldü. WT balık, irkilme tepkisi olarak bilinen, alt daha bazal aktivite dönüşü takip ON ışıklar, motor aktivite kısa bir başak üzerine bir dondurma olarak adlandırılan. WT balık (birkaç dakika içinde) başlangıç ​​lokomotor aktivite dönmek de keskin ışıklar kapalı aşağıdaki hemen lokomotor aktivite artışı ve ancak yavaş yavaş. NRC mutantlar WT balık gibi KAPALI ışığa benzer bir tepki, ama WT balık ile karşılaştırıldığında ortalama aktivite hafif bir azalma gösterebilir. NRC mutantlar ON ışığa tepki olarak motor aktivitede gecikmiş ve halsiz. NRC mutant yanıt yanıt ON WT ışık lambası yavaş bir yükselme zamanı vardır. NRC balık tamamen kör olduğunu işaret etmektedir. Teleosts olmayan retina dokuları ışık tespit Çünkü, biz ışık yoğunluğu değişiklikleri hemen davranışsal tepkilerin tamamen gelişiminin erken evrelerinde gözleri eksikliği chokh (chk) mutantlar kullanarak sağlam göz gerektirir doğruladı. Bizim VMR tayininde, chk mutantlar lateral gözler, bu davranışı aracılık gösteren ya ON ışık ya da KAPALI hiçbir irkilme tepkisi gösterir. VMR testi burada ışık şiddetlerinde değişikliklere yanıt Zebra balığı larvalarının yeteneğini test değildir köklü okr tahlil tamamlar nitelendirdi. Ayrıca, VMR testinin otomasyon ışık şiddeti tahrik görsel tepkiler kusurları için yüksek verimlilik tarama kendisini katıyor.

Protocol

Bu protokol, kendi laboratuvarı hafif artışlarla ve azaltır Zebra balığı larvalarının Görsel-Motor Yanıt gerçekleştirmek için gereken adımları özetliyor. Zebra balığı davranışsal çalışmalar için harika bir model sistem. Bakımı kolay, onlar büyük bir kavrama boyutları var ve bunlar hızla gelişir. Örneğin, gözleri Zebra balığı larvalarının gelişim 3 gün ve bir irkilme tepkisi gösterir ve bu süre ışığa duyarlı.

Bölüm 1: 96 plaka bireysel balık Kaplama

1. 28 yaşında bir aydınlık / karanlık döngüsü altında WT larvaları büyütün ° C kadar en az 4 gün fertilizasyon (dpf). Tipik ışık: karanlık döngüsü, 9:00 AM başlayan ve 10 saat ışıkları KAPALI, 11:00 başlayarak 14 saat ışıkları ON. Davranışsal en iyi sonuçlar için, aşırı kalabalık önlemek, genellikle tek bir petri en fazla 50 larva tutmak.
2. 4 dpf'e sonra, 96 plaka zebrafish aktarılacak hazırız. Larvaları daha yüzme oda vermek için, biz genellikle 96-plaka 650 ul büyük bir iyi boyutu ile kullanmak; Ancak, standart 96-kuyucuğu sadece iyi çalışır. Plastik bir transfer pipetlemeyin kullanarak, hafifçe ortalama bir larva transferi.
3. Kuyulara balık aktardıktan sonra her bir kuyu, kuyu üstüne su yüzeyinde neredeyse aynı hizada olduğu gibi yeterli balık su doldurun. Ya aşırı doldurmaktan ya da iyi underfilling kayıt kamera için optik sorunlara neden olabilir. Ayrıca, kuyuların içine kabarcıklar tanıtmak için özen gösterin.

Bölüm 2: kayıt cihazları Anketi

Protokolün bu kısmı için, lütfen filmi bileşenleri tanımlamak için başvurun ve kayıt cihazları kurmak daha yakından tanımak için.

1. Kayıt odanın içinde 96-plaka konumlandırmak için iyi tanımlanmış bir yerdir.
2. Kamera arkasına yerleştirilmiş ve kutu kapalı aynalar kullanarak plaka üzerine odaklanmıştır. Yerde aynalar tutan vidaları çevirerek bu aynalar açısı ayarlanabilir.
3. Kayıt odasına kızılötesi LED alttan aydınlatılır. Bu kamera karanlıkta bile balık görmenizi sağlar. Larvaları kızılötesi ışık tespit edemez, bu sabit IR aydınlatma deney etkilemez. Beyaz LED'ler ayrıca aşağıdaki kayıt odasına aydınlatır. Kızılötesi ışıklar ayrı ayrı kontrol edilir. Yukarıda ya da yanlarda beyaz ışık ile donatıldı Aydınlatıcı kesinlikle mümkündür, ancak, bu durumda, bakım kamera ile etkileyebilir su yüzeyinden güçlü glares önlemek için alınması gerekir.
4. Birkaç saat daha uzun ömürlü, deneme süresi boyunca sabit bir sıcaklıkta korumaya yardımcı olmak için hafifçe akan su haznesi doldurmanız deneyler için. Sabit bir su akışı gerçekleştirmenin bir yolu, tipik bir sualtı akvaryumu ısıtıcı ile 28 ° 'ye kadar ısıtılan küçük bir akvaryum pompası bir rezervuar su pompası.
5. Oda sokak titreşimi en aza indirmek için, tüm kayıt ünitesi ağır bir denge tablo tepesine oturmak gerekir.

Bölüm 3: 96-plaka, video izleme, bilgisayar ızgara ile uyumu

Yazılım

1. Kayıt odasına balık içeren 96-plaka koyun.
2. Bir su banyosu kullanırken, yavaş yavaş su seviyesi plaka üzerine dökülüp olmadan ayarlamak için bir şans vermek, su, tabak yerleştirin. Alternatif olarak, su akışı kapatmak plaka ekleyin ve sonra akışı devam. Ayrıca, 96 plaka yerinde tutmak için bir bahar ya da bir lastik bant kullandığınızdan emin olun.
3. Viewpoint Videotrack yazılımı denemenizi tüm larvaları bilgisayar ekranında görünür olup olmadığını kontrol edin. Yazılım kontrollerini kullanarak video izleme yazılımı, her balık ızgara bir kare içinde böyle plaka kuyuları ile ızgara hizalayın. Izleme bilgisayar, bilgisayar ızgara hizalarını bazı balık hareketleri kaybolmuş olabilir, bu kutuları her biri için ayrı ayrı hareket hesaplanırken olacaktır. Veya daha da kötüsü: bitişik iki balık aynı alanda yer alacak ve bir balık olarak sayılabilir. Bu adım, tüm kayıtlar için çok önemlidir.
4. Hizalama sonra, program, ışıklar açık ve kapalı gitmeli zamanlama. Genellikle 3 saat kutuya ışık veya karanlık adaptasyonu hem bazal aktivite düzeyi elde etmek için izin verir, ama aynı zamanda larvaları pipetleme ve taşıma sakinleştirmek için bir fırsat vermek. Temel sonra, biz o zaman 30 dakika 30 dakika KAPALI ışıkları takip ON ışıkları ile alternatif ve birkaç kez tekrarlayın.
5. Daha sonra, kayıt odasının kapısını kapatın ve kaydetmeye başlayın.
6. Uygulamada (film bakın, biz, saniyede her bir balık aktivite kayıt, ancak aslında Açısından yazılım çerçeve çerçeve verileri kaydederveri toplama bir gösteri için). Kare başına en az piksel değiştirmek için eşik değeri ayarlama özel kamera ve ışık ayarları biraz bağlı olacaktır. Kurulum için, biz genellikle bir eşik 4 piksel kullanmak; az 4 piksel değişiyor, arka plan olarak kabul edilir,. Eğer 4'ten fazla piksel hareket ediyor, balık hareketli olduğunu gösterir. Biz ampirik bu kesim hemen hemen tüm larva yüzmek ve dönüş hareketleri algılar belirlenir.
7. Kayıt kutularını oldukça iyi olsa da, larvaları izole odada ışığı kapatın ve oda kapıları açma ve kapama, bir dans partisi olan, ya da egzersiz rutinleri gibi mekanik gürültü ile kesintileri en aza indirmek için dikkat.

Bölüm 4: Veri Analiz

1. Deney tamamlandıktan sonra, bir excel sayfasına veya favori analiz adasının içine toplanan veri aktarımı.
2. Ekli excel dosyasına veri ne gibi görünebilir bir örnektir: saniye içinde, tüm deney boyunca tüm balıklar için her saniyede larva deney ve faaliyetin başlangıç ​​zamanı (ek dosya Örnek Veri içerir Bu sayfanın Dosyalar bölümü).
   
   
3. Şekil 1. Tek bir larva faaliyet gösteren bir örnek gösterir. Şekil 2, 40 WT Zebra balığı larvalarının ortalama temsil eden bir eser. ON ve OFF yanıtları ortalama belirgin ve tutarlı.
   
   
   
   Şekil 1: tek bir balık Aktivitesi faaliyet dönemlerinde değişen 30 dakika ışık ON ve OFF yanıt olarak, tek bir dpf'e 5 WT balık . ON yanıtlar, siyah oklar ve kırmızı oklarla OFF yanıtları ile gösterilir.
   
   
   
   Şekil 2: 40 balık ortalama faaliyet dönemlerinde değişen 30 dakika ışık ON ve OFF yanıt 5 dpf'e az 40 WT balık ortalama aktivite. ON ortalama (siyah ok) ve OFF (kırmızı oklar) yanıtları belirgin ve tutarlı.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 3, tüm deneylerin kullanılan deneysel anahat şematik bir anahat.



Şekil 3. Görsel Motor Tepkisi (VMR) testi Deneysel tasarım A) Bireysel balık bir kayıt odasına 96-plaka yerleştirilir. Her balık faaliyet saniyede ölçülür. B) Balık, bunları halletmek için de bir temel aktivite düzeyi elde etmek için koyu veya açık uyum bir süre verilir. 3 saat olmak üzere toplam 30 dakika İLİŞKİN ışıkları ve ışıkların Sürelerinin OFF ardışık olarak tanıtılmaktadır. Bu şema Prober ark adapte oldu, 2006.

Görsel-Motor Yanıt grafikleri neye benziyor?

Biz ışık artırır ve azaltır WT balık ON ve OFF tepkiler ölçülür. Bu tepkiler göz fonksiyonu bağlı olduğunu onaylamak için, biz herhangi bir gözleri geliştirmek chk mutantlar aktivitesini ölçtük . Şekil 4 WT hayvanların yanı sıra chk mutantlar elde edilen ortalama faaliyet göstermektedir.



Şekil 4: WT balık lateral gözler aracılı yanıtları ON ve OFF açık var, 30 dakika ve 30 dakika hafif OFF ışığı yanıt 5 dpf'e Zebra balığı larvalarının lokomotor davranış saniyede kaydedilir . Her eser, 120 bireysel WT (mavi trace) veya chk mutant larvaları (turuncu iz) 3 deney içinde kaydedilen 480 yanıtların ortalama temsil eder . Chk mutantlar ışık artırır veya azaltır ya da önemli ölçüde faaliyetlerini artırmak ve aktivitesi düşük bir temel seviyesine sahip değilsiniz . Bu rakam, Emran ve ark, 2007 uyarlanmıştır.

NRC mutant balık Görsel-Motor Yanıtları.

NRC mutant okr testi dayalı tamamen kör olduğu düşünülüyordu. NRC mutant, fotoreseptör terminalleri düzgün formu değil ve ciddi görme yolarının ¹ tehlikeye. Bu mutant balık retina ganglion hücre kayıtları, bunlar ağırlıklı olarak OFF-tipi ganglion hücre tepkiler, bazı anormal ^ON-OFF, ancak 2-tipi yanıtları saf sergilediği saptandı.

VMR testi kullanılarak NRC mutant normal bir OFF-yanıt ve geç ve cansız ON-yanıt olduğunu göstermiştir (see Şekil 5). Böylece, NRC mutant daha önce ² düşündüğü gibi tamamen kör değildir.


Şekil 5: NRC mutats ışık şiddetlerinde değişikliklere yanıt olarak etkinliği artırmak Davranışsal tepkiler WT ve NRC mutant 5 dpf larvaları ışık ON ve OFF. Her bir eser, her genotip 120 bireysel balık 480 yanıtların ortalama temsil eder. NRC mutantlar ortalama lokomotor davranış (pembe izleri) biraz WT balık (mavi izlerini) ile karşılaştırıldığında azalır ama uyaran KAPALI ışığında aşağıdaki dinç kalır. ON ON WT balık tepki ışığa göre ışık NRC mutant yanıt yavaş yükselme zamanı unutmayın .

Discussion

Film gösteren deneysel prosedürleri WT balık bütün temsilcisi. Ancak, bu deneyler de mutant balık (temsili bir sonuç bölümüne bakınız) analog olarak yapılabilir. Biz optimal kontrol amaçlı bir denetimi kurulu anahat aynı plaka plaka WT balık ve mutant balık öneririz.

WT balık aynı plaka üzerinde mutant balık, balık türü, her bir kuyunun kaplama ne yazmak emin olun. Burada her iyi kaplama balık (veri levha ile not defteri göster) takip etmek için nasıl bir öneri.

Ayrıca, bu günün aynı zamanda belli bir deneyi tekrarlar yapmak en iyisidir. 12:00 (öğle) temel aktivite elde etmek için 3 saat karanlık adaptasyonu başlamadan Örneğin, aşağıdaki veri setleri için aynı anda aynı deneyi tekrarlayınız.

Ayrıca, balık yoğunluğunu değiştirir gün boyunca karşı gece boyunca ışık daha aktif ve duyarlı olarak gün boyunca deneyler yapmak.

Biz Viewpoint Lifesciences nicemleme modunda Videotrack yazılımını kullanmıştır. Ancak, Noldus.Or gelen EthoVision dahil olmak üzere diğer comerically izleme sistemleri, diğer yapılması labshave olarak, kendi izleme yazılım tasarımı youcould vardır.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman, GE Healthcare	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR international	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences