Summary
这个视频演示的甲基化的DNA免疫（MeDIP）协议。 MeDIP是有选择性地从基因组DNA样本中提取5 - 甲基胞嘧啶甲基化的DNA片段具有特异性抗体（抗- 5 MC）为期两天的过程。
Abstract
识别DNA甲基化模式是表观遗传学的研究的一个常见的程序，作为甲基化是已知的基因表达有显着影响，并与参与的正常发展，以及疾病
Protocol
DNA的提取和样品制备
从各种不同的样品（培养细胞，新鲜冰冻以及福尔马林固定石蜡包埋组织）的DNA可用于MeDIP。重要的是要使用不相关的蛋白质，如组蛋白高度纯化的DNA。同样重要的是删除尽可能多的RNA样品，因为它可以干扰DNA定量和抗体结合。 MeDIP使用的DNA的数量，范围可以从200毫微克至1微克，取决于可用的DNA量。为了证明这个协议，1微克的DNA将被使用。下面的协议，将提供高品质的双从培养细胞的双链DNA。应采用其他类型的样品中提取DNA的其他协议。
- 消化缓冲液加入400μL至1.7 mL Eppendorf管中的细胞沉淀。
- 添加100微克的蛋白酶K管，并培育一夜之间在50 ° C。
- 加入500μL酚pH值7和反相轻轻，但彻底混合。
- 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
- 删除一个新的管水（顶部）分数。
- 重复步骤1至5 3一次。
- 加入500μL1:1的酚/氯仿的pH值7和反相轻轻，但彻底混合。
- 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
- 删除一个新的管水（顶部）分数。
- 添加40微克的RNA酶A孵育1小时，在37 ° C。
- 加入500μL酚pH值7和反相轻轻，但彻底混合。
- 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
- 删除一个新的管水（顶部）分数。
- 重复步骤13 11一次。
- 加入500μL1:1的酚/氯仿的pH值7和反相轻轻，但彻底混合。
- 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
- 删除一个新的管水（顶部）分数。
- 加入十分之一体积的3 M醋酸钠（40μL），拌匀。
- 100％的乙醇添加2卷（900μL），拌匀，并在-20 ° C为20分钟。
- 20分钟旋转13 000克在4 ° C。
- 除去乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇。
- 加入500μL70％冷乙醇洗。 20分钟旋转13 000克在4 ° C。
- 取出70％的乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇吹打。
- 空气干燥，在室温为10分钟，以去除残留的乙醇的所有痕迹开放的第沉淀。
- 悬浮的DNA，在50μL灭菌dH2O一夜之间在4 ° C
- 使用NanoDrop分光光度计量化的DNA。一个A 260：280的比例为1.8，是理想的。
- 确定100个基点阶梯琼脂糖凝胶上的DNA的质量和尺寸范围。可低至10纳克的基因组DNA 1.7％琼脂糖凝胶上运行，使用的染料，染色是高度敏感，少量的DNA，如SYBR黄金。
- 在每一个样品的硅化管中，准备与该卷的其余部分在总体积50μL，1微克的DNA 与消毒 生署2 O
DNA的超声
DNA超声和MeDIP协议必须执行siliconzied管，以防止非特异性结合蛋白管壁。凝胶电泳（27步）确定的DNA样本碎片程度的基础上的DNA样本的最佳超声倍。例如，从培养细胞中提取的DNA应该是非常高的分子量，并随后将需要更多的超声比这往往是部分降解的档案样本中提取DNA。如果样品是均匀的超高分子量，在这一点上，合理进行在本议定书中所描述的没有单独检查每个样品的超声。如果样品零散档案样本，就必须适应超声过程可能通过减少超声次获得300 - 100bp片段。如果您希望处理样品，部分降解，超声参数的优化，可以从利益的代表性样本进行。基于观察到的DNA片段从凝胶电泳（27步）的程度，实验者可以预先确定样品的最佳超声时间。在这里，我们描述了一种方法来获得超声与自动化超声设备使用超高分子量DNA（Bioruptor从Diagenode，UCD - 200 TM）300-1000 bp的DNA片段。
- Biorupter水必须在4 ° C
- 超声用于自动设置的7分钟（30秒30秒在最大功率）。
- 删除超声产品和硅化离心管1.7毫升的免疫反应（IP）的800毫微克（40μL）。
- 抛开其余200纳克（10μL）作为输入（IN）的参考DNA（储存在4 ° C）。
IMMUNOPRECIPITATON的甲基化的DNA
- 变性的，将用于在95℃水浴10分钟IP反应（800纳克）的DNA。
- 酷立即在冰上。让我们的DNA完全冷却（约5分钟冰），然后再继续下一步。
- 新增5微克单克隆抗体。
- 添加IP缓冲液（在室温下使用整个协议）至终体积为500μL。
- 旋转管持有人在2小时在4 ° C孵育。
- 就在第5步完成后，准备磁珠洗涤（步骤6-11）。首先，重悬在小瓶珠彻底震荡。
- 30μL反应加1％的悬浮磁珠（1〜2 × 10 7）转移到一个新的硅化管（例如，8反应，如果这样做，删除9，即270μL足够珠） 。
- 上放置在室温下2分钟的磁架管。
- 移液器关闭上清。当去除上清，避免接触枪头对内壁珠（珠磁铁吸引）。
- 取出磁铁管，并在IP缓冲区的过剩量（750μL1000μL）重悬珠。回放置在室温下2分钟的磁架管。
- 重复洗一次，然后在第7步中删除原始卷重悬在IP缓冲区的水洗珠。
- 加入30μL洗磁珠每个IP反应
- 旋转管持有人在2小时孵育4 ° C。
- 孵化完成后，放在磁架管，在室温下2分钟。
- 移液器关闭上清。枪头，避免接触管内壁（珠磁铁吸引）。加入500μLIP缓冲区。混合管的内容，并把2分钟的磁架。重复用500 UL IP缓冲区一次。
- 删除最后一次洗涤上清液后，重悬在400消化缓冲液珠。
- 治疗蛋白酶K与100微克的反应，并培育一夜之间在50 ° C。
免疫沉淀的DNA的分离纯化
- 添加500μL1:1的酚/氯仿pH值7和涡彻底。
- 在13个000克的自旋在室温下约10分钟。
- 删除一个新的管水（顶部）分数。
- 重复步骤1到3，如果水相和有机层之间的相间出现浑浊。
- 加入1 / 10体积3 M醋酸钠（40μL）和涡。
- 新增的糖原（20微克/μL）1μL和旋涡。
- 添加100％的乙醇，涡旋，并在-20 ° C 20分钟2卷（1000μL）。
- 20分钟旋转13 000克在4 ° C。
- 除去乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇。
- 加入500μL70％冷乙醇洗。涡简单地说，在13个000克的自旋为20分钟，4 ° C。
- 取出70％的乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇吹打。
- 空气干燥，在室温为10分钟，以去除残留的乙醇的所有痕迹开放的第沉淀。
- 悬浮在10μL的DNA沉淀消毒生署 2 0 。
通过PCR验证
- 您可能会测试，以确保MeDIP程序正在执行MeDIP协议，使用正常的人类DNA（男性或女性），随后化验已知的甲基化丰富的一个区域。
- 删除30％的MeDIP产品，PCR管和其他MeDIP产品的30％到另一个PCR管。
- 将PCR管成10 ng的DNA中，和10纳克到另一个PCR管中的DNA。您现在应该已经设立4个独立的PCR反应。
- 执行PCR扩增H19和CTRL引物如表1所示。
- 准备两个mastermixes（每个引物之一），如表2所列为12.5μL总体积的PCR反应。
- Thermocycle的PCR用在表3所列的的条件。
- 5μLPCR产物在2％琼脂糖凝胶的可视化运行。
- 对成功MeDIP的预期结果如表4所示。
表
表1：H19和CTRL引物进行PCR验证。
引物 正向引物 反向引物 预期产品尺寸 H19 H19_F 5' - cgagtgtgcgtgagtgtgag H19_R 5' - ggcgtaatggaatgcttgaa 174 BP Ctrl（控制） CTRL_F5' - gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5' - gttcctcagacagccacattt 139 BP 表2。用于PCR反应Mastermixes。
H19混合（每RXN） CTRL键组合（每RXN） 6.875 6.875 10X缓冲 1.25 1.25 dNTP混合液（10毫米） 0.25 0.25 MgCl 2的 （50毫米） 0.25 0.25 引物（H19_F / R或CTRL_F / R）（10微米每个F / R） 0.625 0.625 白金Taq酶 0.25 0.25 表3。 PCR thermocyling条件。
95℃ 5:00 40X 95℃ 0:30 56℃ 0:30 72℃ 0:15 表4。预期的成功MeDIP PCR结果。
模板DNA 底漆使用 在 知识产权 H19 积极的 积极的 按Ctrl 积极的 负面
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Discussion
有一个日益认识到疾病的DNA甲基化起着重要作用，因此发展的分析来衡量这一修改正在成为越来越重要的3，12，13 。 MeDIP技术是筛选适合的工具，同时在全基因组位点特异性的第6级 ， 7。这种技术提供了一个快速查看和使用数量有限的起始DNA的DNA甲基化水平，为便于比较不同来源之间允许。使用该MeDIP产品的下游应用领域包括各种芯片的全基因组CpG岛寡核苷酸阵列，直接PCR检测位点的利益，以及测序等。
MeDIP根据区分甲基化和甲基化的DNA 6抗体依赖的DNA甲基化检测提供了一个独特的方法。虽然MeDIP速度比传统的硫酸氢钠测序方法，它不局限于特定的序列，如限制性内切酶分析分析，免疫将包括CPG密度，重复元素的存在和组成DNA序列上的依赖。因此，适当的控制，每一个实验，是非常重要的MeDIP结果的分析和解释。
有几个步骤是整个MeDIP技术，必须采取额外的照顾。这些措施包括：硅化管的使用，以防止非特异性DNA结合管壁，确保足够的超声处理后的DNA碎片，并确保DNA完全变性。此外，请注意，单链MeDIP产品的量化可能很困难，因为有一个材料和许多共同的技术，估计DNA的数量，如分光光度法，数量有限，工作最好的双链DNA。此外，重要的是要时刻遵守适当的实验室安全守则，尤其是当使用腐蚀性物质，如苯酚。
MeDIP技术还可以在以下几个步骤进行修改。重要的是，协议可以扩大或向下，让有限的样本大小增加产量，或工作。另一种碎片的方法，如使用限制性内切酶（如铝我消化），降低了设备的要求，但可能会限制在一些地区的DNA拉，也可以引进偏见。至于用任何方法，结果是最好的验证使用一种替代方法，以DNA甲基化检测，14 。
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Acknowledgments
我们要感谢布朗和林实验室的成员，他们在参与此视频和文章批判。这项工作是由从加拿大健康研究和迈克尔史密斯健康研究基金会研究院的资金支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb | Reagent | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
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