Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Метилированный Иммунопреципитация ДНК

Published: January 2, 2009 doi: 10.3791/935
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,3, 5, 5, 1,2,3, 1,3
1Department of Cancer Genetics and Developmental Biology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC, 4Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 5Department of Medical Genetics, Life Sciences Institute,, University of British Columbia - UBC
* These authors contributed equally

Summary

Это видео демонстрирует протокол для метилированной иммунопреципитации ДНК (MeDIP). MeDIP является двухдневной процедуры, которые селективно экстракты метилированных фрагментов ДНК из генома образцов ДНК с использованием антител со специфичностью для 5-метилцитозин (анти-5 MC).

Abstract

Выявление закономерностей метилирование ДНК является обычной процедурой в изучении эпигенетика, как метилирование, как известно, оказывают значительное влияние на экспрессию генов, и участвует с нормальным развитием, а также болезни

Protocol

Выделения ДНК и подготовки проб

ДНК из различных образцов (культивированных клеток свежемороженая, а также фиксированных формалином и залитые парафином ткани) может быть использован для MeDIP. Важно использовать высокоочищенного ДНК, не связанные белки, такие как гистонов. Важно также, чтобы удалить как можно больше РНК, как можно дальше от образца, так как это может помешать как количественного ДНК и антитела. Количество ДНК используется для MeDIP может варьироваться от 200 нг до 1 мкг в зависимости от количества ДНК доступны. Чтобы продемонстрировать это протокол, 1 мкг ДНК будет использоваться. Следующий протокол обеспечит высокое качество двухцепочечной ДНК из культивируемых клеток. Другие протоколы должны быть использованы для извлечения ДНК из других типов образца.

  1. Добавить 400 мкл буфера для пищеварения осадок клеток в 1,7 мл трубки Эппендорф.
  2. Добавить 100 мкг протеиназы К в трубке, и инкубировать в течение ночи при 50 ° C.
  3. Добавить 500 мкл фенола рН 7 и аккуратно перемешать, но тщательно обращением.
  4. Спиновые на 13 000 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
  5. Удалить водный (вверху) фракции в новую пробирку.
  6. Повторите шаги с 3 по 5 раз.
  7. Добавить 500 мкл 1:01 фенол / хлороформ рН 7 и аккуратно перемешать, но тщательно обращением.
  8. Спиновые на 13 000 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
  9. Удалить водный (вверху) фракции в новую пробирку.
  10. Добавить 40 мкг РНКазы и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
  11. Добавить 500 мкл фенола рН 7 и аккуратно перемешать, но тщательно обращением.
  12. Спиновые на 13 000 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
  13. Удалить водный (вверху) фракции в новую пробирку.
  14. Повторите шаги с 11 по 13 раз.
  15. Добавить 500 мкл 1:01 фенол / хлороформ рН 7 и аккуратно перемешать, но тщательно обращением.
  16. Спиновые на 13 000 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
  17. Удалить водный (вверху) фракции в новую пробирку.
  18. Добавить 1/10th объема 3 М ацетата натрия (40 мкл) и хорошо перемешать.
  19. Добавить 2-х томах (900 мкл) в размере 100% этилового спирта, хорошо перемешайте, и место при температуре -20 ° С в течение 20 минут.
  20. Спиновые на 13 000 г в течение 20 мин при 4 ° C.
  21. Удалить этанола, пульс спина и удаления остатков этанола.
  22. Добавить 500 мкл холодного 70% этанола мыть. Спиновые на 13 000 г в течение 20 мин при 4 ° C.
  23. Удалить 70% этанола, пульс спина и удаления остатков этанола с помощью пипетки.
  24. Воздух сухой шарик с открытой крышкой в ​​течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы удалить все следы остаточной этанола.
  25. Ресуспендируют ДНК в 50 мкл стерилизованной dH2O течение ночи при 4 ° C.
  26. Количественная ДНК с использованием NanoDrop спектрофотометр. 260: 280 Отношение 1,8 идеально.
  27. Определить качество ДНК и размер диапазона на агарозном геле с 100 б.п. лестнице. Как ни мало 10 нг геномной ДНК может быть запущен на 1,7% агарозном геле последующим окрашиванием использования краситель, который обладает высокой чувствительностью к небольшим количеством ДНК, таких как золото SYBR.
  28. В одном силиконовая трубка на один образец, подготовить 1 мкг ДНК в общем объеме 50 мкл с остатком от объема составил стерилизованной дН 2 O.

ДНК ультразвуком

ДНК ультразвуком и протокол MeDIP должны быть выполнены в siliconzied труб для предотвращения неспецифического связывания белков в стенках трубы. Оптимальное раз ультразвука для образцов ДНК основаны на степень фрагментации ДНК образца определяется из гель-электрофореза (шаг 27). Например, ДНК, извлеченной из культивируемых клеток должна быть очень высокой молекулярной массой, и впоследствии потребуется больше, чем ультразвуком ДНК, извлеченной из архивных образцов, которые нередко частично деградировали. Если образцы равномерно высоким молекулярным весом, целесообразно на данном этапе, чтобы продолжить обработку ультразвуком, как описано в данном протоколе, не проверяя каждый образец индивидуально. Если образцы фрагментированы, как и архивных образцов, необходимо будет адаптировать процедуру обработки ультразвуком вероятно, за счет уменьшения ультразвуком раз для получения 300-100bp фрагментов. Если вы ожидаете для обработки образцов, которые частично деградировали, оптимизация обработки ультразвуком параметров может быть выполнено на репрезентативной выборке из этих интересов. На основании степень фрагментации ДНК наблюдается с гель-электрофореза (шаг 27), экспериментатор может предопределить оптимальное время обработки ультразвуком для образца. Здесь мы опишем метод получения фрагментов 300-1000 п.н. ДНК ультразвуком с автоматизированной sonicating устройства (Bioruptor от Diagenode, UCD-200 TM) с использованием высокой молекулярной ДНК веса.

  1. Вода в Biorupter должны быть при 4 ° C.
  2. Разрушать ультразвуком в течение 7 минут на автоматической настройки (30 сек, 30 сек с при максимальной мощности).
  3. Удалить 800 нг (40 мкл) ультразвуком продукт и место в силиконизированный 1,7 мл центрифужную пробирку для иммунопреципитации (IP) реакции.
  4. Отложите оставшиеся 200 нг (10 мкл) в качестве входных (IN) ссылка ДНК (хранить при 4 ° С).

    IMMUNOPRECIPITATON метилированных ДНК

    1. Денатурации ДНК, который будет использоваться для IP-реакции (800 нг) при 95 ° С в течение 10 минут на водяной бане.
    2. Прохладный сразу на лед. Давайте ДНК полностью остыть (примерно 5 минут на льду), прежде чем приступать к следующему шагу.
    3. Добавить 5 мкг моноклональных антител.
    4. Добавить IP-буфер (используется при комнатной температуре на протяжении всего этого протокола) для конечного объема 500 мкл.
    5. Инкубируйте в течение 2 часов при температуре 4 ° C во вращающихся держателя трубки.
    6. Незадолго до шага 5 завершения подготовки Dynabeads промывкой (шаги 6-11). Во-первых, ресуспендируют бисером тщательно во флаконе по вортексе.
    7. Передача 30 мкл (~ 2 * 10 7) ресуспендировали Dynabeads на реакцию плюс 1, в новый силиконовая трубка (например, если это 8 реакций, достаточно удалить шарики для 9, т.е. 270 мкл).
    8. Поместите пробирку на магнитной стойке в течение 2 мин при комнатной температуре.
    9. Внесите от супернатант. При удалении супернатант, старайтесь не прикасаться бисером против внутренней стене (там, где бисер привлечь к магниту) с кончика пипетки.
    10. Снимите трубку от магнита, и ресуспендируют бусины превышение объемов IP-буфера (750 мкл-1000 мкл). Место трубку обратно на магнитной стойке в течение 2 мин при комнатной температуре.
    11. Повторите еще раз мыть, а затем ресуспендируют мыть бисером в IP-буфера в первоначальный объем удален на шаге 7.
    12. Добавить 30 мкл мыть Dynabeads каждому IP-реакции
    13. Инкубировать во вращающейся трубки держателя в течение 2 часов при 4 ° C.
    14. После инкубации завершения место трубки на магнитной стойке в течение 2 мин при комнатной температуре.
    15. Внесите от супернатант. Не прикасайтесь к внутренней стенке трубки (где бисером привлечь к магниту) с кончика пипетки. Добавить 500 мкл IP-буфера. Смешайте содержимое пробирки и положил его обратно на магнитной стойке в течение 2 мин. Повторите промыть 500 мкл буфера IP один раз.
    16. После удаления надосадочной из последних мыть, ресуспендируют бисером в 400 мкл буфера пищеварения.
    17. Лечить реакции с 100 мкг протеиназы К и инкубировать в течение ночи при 50 ° C.

    ОЧИСТКА иммунопреципитации ДНК

    1. Добавить 500 мкл 1:01 фенол / хлороформ рН 7 и вихревые тщательно.
    2. Спиновые на 13 000 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
    3. Удалить водный (вверху) фракции в новую пробирку.
    4. Повторите шаги с 1 по 3, если межфазное между водной и органической слоев появляется облачность.
    5. Добавить 1 / 10-го объема 3 М ацетата натрия (40 мкл) и вихрь.
    6. Добавить 1 мкл гликогена (20 мкг / мкл) и вихрь.
    7. Добавить 2-х томах (1000 мкл) в размере 100% этанол, вихрь, и место при температуре -20 ° С в течение 20 минут.
    8. Спиновые на 13 000 г в течение 20 мин при 4 ° C.
    9. Удалить этанола, пульс спина и удаления остатков этанола.
    10. Добавить 500 мкл холодного 70% этанола мыть. Vortex кратко, и вращаются на 13 000 г в течение 20 мин при 4 ° C.
    11. Удалить 70% этанола, пульс спина и удаления остатков этанола с помощью пипетки.
    12. Воздух сухой шарик с открытой крышкой в ​​течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы удалить все следы остаточной этанола.
    13. Ресуспендируют ДНК гранул в 10 мкл стерилизованной дН 2 0.

    Проверка по ПЦР

    1. Вы можете проверить, чтобы убедиться, что ваш MeDIP процедура работает, выполняя протокол MeDIP с помощью обычной человеческой ДНК (мужчина или женщина), а затем опробование регионе, как известно, обогащенные для метилирования.
    2. Удаление на 30% продукта MeDIP для ПЦР-пробирку, а еще 30% продукции MeDIP на другой трубке ПЦР.
    3. Положите 10 нг В ДНК в ПЦР-пробирку, и 10 нг В ДНК в другой ПЦР-пробирку. Теперь вы должны иметь четыре отдельных реакций ПЦР в настройке.
    4. Выполните ПЦР с использованием H19 и CTRL грунтовки, как указано в таблице 1.
    5. Приготовьте два mastermixes (по одному для каждого праймера комплект) для ПЦР-реакции с 12,5 мкл общего объема, как указано в таблице 2.
    6. Thermocycle ПЦР, используя условия, изложенные в таблице 3.
    7. Выполните 5 мкл ПЦР-продуктов на 2% агарозном геле для визуализации.
    8. Ожидаемые результаты для успешного MeDIP приведены в таблице 4.

    Таблицы

    Таблица 1: H19 и CTRL праймеров для проверки ПЦР.

    Грунтовка Установить Форвард Primer Обратный праймер Ожидаемые Размер Продукт
    H19 H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa 174 б.п.
    CTRL (контроль) CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt 139 б.п.

    Таблица 2. Mastermixes для реакции ПЦР.

    2 O
    H19 Mix (в Rxn) CTRL Mix (в Rxn)
    6,875 6,875
    10X Буфер 1,25 1,25
    дНТФ смеси (10 мМ каждого) 0,25 0,25
    MgCl 2 (50 мМ) 0,25 0,25
    Грунтовки (H19_F / R или CTRL_F / R) (10 мкМ каждого F / R) 0,625 0,625
    Платиновый Taq 0,25 0,25

    Таблица 3. ПЦР thermocyling условиях.

    95 ° C 5:00
    40X
    		95 ° C 0:30
    56 ° C 0:30
    72 ° C 0:15

    Таблица 4. Ожидаемые результаты ПЦР для успешного MeDIP.

    Шаблон ДНК
    Грунтовка использоваться В IP
    H19 Положительный Положительный
    CTRL Положительный Отрицательный

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует растущее осознание значительную роль метилирования ДНК играет в болезнь, поэтому развитие тесты для измерения этого изменения становятся все более важными 3, 12, 13. Техника MeDIP это поддается инструмент для скрининга на обоих целого генома и локус-определенного уровня 6, 7. Эта технология обеспечивает быстрый просмотр метилирования ДНК уровнях, используя ограниченное количество, начиная ДНК и позволяет легко сравнивать между различными источниками. Переработка приложений, использующих MeDIP продукта включают в себя различные микрочипы, таких как целого генома и CpG массивы олигонуклеотидных острове, прямые анализы ПЦР для локусов интересов, а также последовательности.

MeDIP обеспечивает различных подхода к метилирования ДНК обнаружения, который основывается на антитела к отличать метилированных и ДНК неметилированный 6. Хотя MeDIP быстрее, чем традиционные бисульфит последовательности подходов и она не ограничивается анализом специфических последовательностей, как ограничение анализа фермент, иммунопреципитации будет зависеть от последовательности ДНК, в том числе CpG плотность, наличие повторяющихся элементов и композиции. Таким образом, соответствующие элементы управления, как с каждым экспериментом, которые важны для анализа и интерпретации MeDIP результаты.

Есть несколько шагов всей MeDIP техники, где дополнительная забота должна быть взята. К ним относятся: использование силиконизированный труб для предотвращения неспецифического связывания ДНК к стенкам трубки, обеспечение адекватной фрагментации ДНК после обработки ультразвуком, а также обеспечение того, чтобы ДНК полностью денатурированной. Кроме того, обратите внимание, что количественное одноцепочечной MeDIP продукт может быть трудным, потому что есть ограниченное количество материала, и многие общие методы для оценки количества ДНК, такие как спектрофотометрия, лучше всего работают с двухцепочечной ДНК. Кроме того, важно соблюдать надлежащую практику лабораторную безопасность во все времена, особенно когда едких веществ, таких как фенол используются.

MeDIP метод также может быть изменено в несколько этапов. Важно протокол можно масштабировать вверх или вниз, чтобы повысить урожайность, или работать с ограниченным размером выборки. Альтернативный подход фрагментации, такие как использование ферментов рестрикции (например Alu я пищеварения), снижает требования к оборудованию, но можно также ввести предубеждения потенциально ограничивающих ДНК выпадающего в некоторых регионах. Как и любой подход, результаты лучше проверяются с помощью альтернативного подхода к метилирования ДНК обнаружения 1, 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить членов Браун и Лам лабораторий для их участия в критике это видео и статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств от канадских институтов по исследованиям в области здравоохранения и Майкл Смит фонда исследований в области здравоохранения.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Biorupter sonicator Tool Diagenode UCD-200 TM
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes Other Sorenson BioScience 11510
ND 3300 Spectrophotometer Tool NanoDrop
Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb Reagent Calbiochem 162 33 D3
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG Reagent Invitrogen 112-01D
Magnetic Tube Rack Tool Invitrogen CS15000
Mini LabRoller Tool Labnet International H5500
IP Buffer 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature
Digestion Buffer 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
  2. Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
  3. Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
  4. Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
  5. Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
  6. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
  7. Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
  8. Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
  9. Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
  10. Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
  11. Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
  13. Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
  14. Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).

Tags

Клеточной биологии выпуск 23 метилирование ДНК иммунопреципитации epigenomics эпигенетика метилцитозин MeDIP протокол 5-метилцитозин антител анти-5-метилцитозин микрочипов
Метилированный Иммунопреципитация ДНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thu, K. L., Vucic, E. A., Kennett,… More

Thu, K. L., Vucic, E. A., Kennett, J. Y., Heryet, C., Brown, C. J., Lam, W. L., Wilson, I. M. Methylated DNA Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (23), e935, doi:10.3791/935 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter