Summary
Este video muestra el protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP). MeDIP es un procedimiento de dos días que selectivamente extrae fragmentos de ADN metilado de una muestra de ADN genómico utilizando anticuerpos con especificidad para el 5-metilcitosina (anti-5 MC).
Abstract
La identificación de los patrones de metilación del ADN es un procedimiento común en el estudio de la epigenética, como la metilación se sabe que tiene efectos significativos en la expresión génica, y está involucrado con el desarrollo normal, así como la enfermedad
Protocol
Extracción de ADN y preparación de muestras
ADN de una variedad de diferentes muestras (células cultivadas, fresco congelado, así como tejidos en parafina fijado en formol e incrustados) puede ser utilizado para MeDIP. Es importante usar el ADN altamente purificado sin proteínas asociadas, como las histonas. También es importante para eliminar el ARN tanto como sea posible de la muestra, ya que puede interferir con la cuantificación del ADN y la unión del anticuerpo. La cantidad de ADN utilizado para MeDIP puede variar de 200 ng a 1 mg dependiendo de la cantidad de ADN disponible. Para demostrar este protocolo, 1 ug de ADN se utiliza. El protocolo siguiente se proporciona una alta calidad ADN de doble cadena a partir de células cultivadas. Otros protocolos deben ser empleados para la extracción de ADN de otros tipos de muestras.
- Añadir 400 l de tampón de digestión a un pellet de células en un tubo de 1,7 ml Eppendorf.
- Añadir 100 mg de proteinasa K en el tubo y se incuban durante la noche a 50 ° C.
- Añadir 500 l de fenol pH 7 y mezclar suavemente pero a fondo por inversión.
- Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo.
- Repita los pasos 3 a 5 una vez.
- Añadir 500 l 1:01 pH fenol / cloroformo 7 y mezclar suavemente pero a fondo por inversión.
- Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo.
- Agregar 40 g de RNasa A y se incuba 1 hora a 37 ° C.
- Añadir 500 l de fenol pH 7 y mezclar suavemente pero a fondo por inversión.
- Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo.
- Repita los pasos 11 a 13 una vez.
- Añadir 500 l 1:01 pH fenol / cloroformo 7 y mezclar suavemente pero a fondo por inversión.
- Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo.
- Añadir un volumen 1/10th acetato de sodio 3 M (40 ml) y mezclar bien.
- Agregar 2 volúmenes (900 l) de etanol al 100%, mezcle bien y coloque a -20 ° C durante 20 minutos.
- Giran a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C.
- Eliminar el etanol, dar un pulso, y retirar el etanol residual.
- Añadir 500 l de etanol 70% frío para lavar. Giran a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C.
- Eliminar 70% de etanol, dar un pulso, y retirar el etanol residual con pipeta.
- Deje secar al aire el precipitado con la tapa abierta durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los rastros de etanol residual.
- Resuspender el ADN en 50 l de dH2O esterilizado la noche a 4 ° C.
- Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Un 260: Una relación de 280 de 1.8 es ideal.
- Determinar la calidad del ADN y el rango de tamaño en un gel de agarosa con escalera de 100 pb. Tan poco como 10 ng de DNA genómico se puede ejecutar en un 1,7% en gel de agarosa seguida de tinción con un colorante que es muy sensible a pequeñas cantidades de ADN como SYBR Gold.
- En un tubo de silicona por ejemplo, preparar a 1 ug de ADN en un volumen total de 50 ml con el resto del volumen se esterilizan con dH 2 O.
ADN sonicación
Sonicación de ADN y el protocolo MeDIP debe realizarse en tubos de siliconzied para impedir la unión no específica de las proteínas de las paredes del tubo. Tiempos óptimos sonicación de las muestras de ADN se basan en el grado de fragmentación del ADN de la muestra determinado a partir de electroforesis en gel (paso 27). Por ejemplo, el ADN extraído de células de cultivo debe ser de muy alto peso molecular, y, posteriormente, se requieren más tratamiento con ultrasonidos que el ADN extraído de muestras de archivo que a menudo son parcialmente degradadas. Si las muestras son de peso molecular alto y uniforme, es razonable en este momento para continuar con el tratamiento con ultrasonidos como se describe en este protocolo sin verificar cada muestra individual. Si las muestras están fragmentadas como con muestras de archivo, será necesario adaptar el procedimiento de ultrasonidos probablemente por la disminución de tiempos de sonicación para obtener 300-100bp fragmentos. Si usted espera para procesar las muestras que están parcialmente degradadas, la optimización de los parámetros de ultrasonidos se puede realizar en una muestra representativa de las de interés. Con base en el grado de fragmentación del ADN observada a partir de electroforesis en gel (paso 27), el experimentador puede predeterminar el tiempo de sonicación óptimo para la muestra. Aquí se describe un método para obtener fragmentos de ADN 300-1000 pb por ultrasonidos con un dispositivo automatizado ultrasonidos (Bioruptor de Diagenode, UCD-200 TM) usando ADN de alto peso molecular.
- De agua en Biorupter debe ser a 4 ° C.
- Sonicar durante 7 minutos de la configuración automática (30 segundos en 30 segundos de máxima potencia).
- Quitar 800 ng (40 l) del producto sonicado y el lugar en el tubo de centrífuga siliconado 1,7 ml de la inmunoprecipitación (IP) de reacción.
- Ponga a un lado restantes 200 ng (10 l) para servir como entrada (IN) de referencia de ADN (se almacenan a 4 ° C).
IMMUNOPRECIPITATON de ADN metilado
- Desnaturalizar el ADN que será utilizado para la reacción IP (800 ng) a 95 ° C durante 10 minutos en un baño de agua.
- Enfriar inmediatamente en hielo. Deje que se enfríe por completo de ADN (aproximadamente 5 minutos en hielo) antes de proceder con el siguiente paso.
- Añadir 5 mg del anticuerpo monoclonal.
- Añadir tampón IP (usado a temperatura ambiente a lo largo de este protocolo) a un volumen final de 500 microlitros.
- Incubar durante 2 horas a 4 ° C en la rotación de soporte del tubo.
- Justo antes del paso 5 se completa, preparar Dynabeads por el lavado (Pasos 6-11). En primer lugar, suspender las cuentas de fondo en el vial con el vortex.
- Transferencia de 30 l (~ 2 x 10 7) de Dynabeads resuspendido por reacción, más 1, en un nuevo tubo siliconado (por ejemplo, si hace ocho reacciones, eliminar las perlas suficiente para 9, es decir, 270 l).
- Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Pipeta el sobrenadante. Al eliminar el sobrenadante, evite tocar las bolas contra la pared interior (donde las cuentas de atraer al imán) con la punta de la pipeta.
- Retire el tubo del imán, y volver a suspender las bolas en un exceso de volumen de buffer de propiedad intelectual (750 l-1000 l). Coloque el tubo de vuelta en la rejilla magnética durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Repetir el lavado una vez más, y luego volver a suspender las cuentas de lavado en buffer de propiedad intelectual en el volumen original retiró en el paso 7.
- Añadir 30 l de Dynabeads lavado para cada reacción de IP
- Incubar en un soporte de tubo giratorio durante 2 horas a 4 ° C.
- Después de incubación, se coloca el tubo en la rejilla magnética durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Pipeta el sobrenadante. Evite tocar la pared interior del tubo (donde las cuentas de atraer al imán) con la punta de la pipeta. Añadir 500 l de buffer de propiedad intelectual. Mezcle el contenido del tubo y vuelva a colocarlo en el estante magnético durante 2 minutos. Repetir el lavado con 500 ul buffer de propiedad intelectual de una vez.
- Después de retirar el sobrenadante del último lavado, suspender las cuentas en 400 l de tampón de digestión.
- El tratamiento de la reacción con 100 mg de proteinasa K y se incuba durante la noche a 50 ° C.
Purificación de ADN immunoprecipitated
- Añadir 500 l 1:01 pH fenol / cloroformo y agitar bien 7.
- Giran a 13 000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Quitar acuosa (superior) de la fracción a un nuevo tubo.
- Repita los pasos 1 a 3 si la interfase entre las capas acuosa y orgánica aparece nublado.
- Añada 1 / 10 del volumen 3 ª M de acetato de sodio (40 ml) y agitar.
- Añadir 1 l de glucógeno (20 mg / l) y agitar.
- Añadir dos volúmenes (1000 l) de etanol al 100%, vórtice, y el lugar de -20 º C durante 20 minutos.
- Giran a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C.
- Eliminar el etanol, dar un pulso, y retirar el etanol residual.
- Añadir 500 l de etanol 70% frío para lavar. Agitar brevemente, y giran a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C.
- Eliminar 70% de etanol, dar un pulso, y retirar el etanol residual con pipeta.
- Deje secar al aire el precipitado con la tapa abierta durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar todos los rastros de etanol residual.
- Resuspender el ADN precipitado en 10 l esterilizados dH 2 0.
VALIDACIÓN POR PCR
- Es posible que la prueba para asegurarse de que su procedimiento MeDIP está trabajando mediante la realización del protocolo MeDIP utilizando el ADN humano normal (hombre o mujer), y, posteriormente, ensayar una región conocida por ser enriquecido por metilación.
- Eliminar 30% del producto MeDIP de tubo de PCR, y otro 30% del producto MeDIP a otro tubo de PCR.
- Puesto de 10 ng de ADN en un tubo de PCR, y de 10 ng de ADN en otro tubo de PCR. Ahora debería tener cuatro por separado las reacciones de PCR de configurar.
- Realizar PCR utilizando primers CTRL H19 y como se indica en la Tabla 1.
- Preparar dos mezclas maestras (una para cada conjunto de cebadores) para las reacciones de PCR con 12,5 l volumen total como se indica en la Tabla 2.
- Thermocycle el PCR con las condiciones establecidas en la Tabla 3.
- Carrera de 5 l de los productos de PCR en un gel de agarosa al 2% para la visualización.
- Los resultados esperados para MeDIP éxito se muestran en la Tabla 4.
Tablas
Tabla 1: H19 y CTRL cebadores para la validación del PCR.
Primer Set Primer avance Primer inversa El tamaño del producto esperado H19 H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa 174 pb CTRL (control) CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt 139 pb Tabla 2. Las mezclas de las reacciones de PCR.
H19 Mix (por Rxn) CTRL Mix (por Rxn) 6.875 6.875 Buffer 10X 1.25 1.25 Mezcla de dNTP (10 mM cada uno) 0.25 0.25 MgCl2 (50 mM) 0.25 0.25 Cebadores (H19_F / R o CTRL_F / R) (10 mM cada F / R) 0.625 0.625 Platinum Taq 0.25 0.25 Tabla 3. PCR thermocyling condiciones.
95 ° C 05:00 40X 95 ° C Doce y media 56 ° C Doce y media 72 ° C Doce y quince Tabla 4. Espera resultados de la PCR para MeDIP éxito.
Plantilla de ADN Primer utilizados EN IP H19 Positiva Positiva CTRL Positiva Negativo
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hay una creciente conciencia de los juegos de rol significativo en la enfermedad de la metilación del ADN, por lo tanto el desarrollo de ensayos para medir esta modificación se están convirtiendo cada vez más importante 3, 12, 13. La técnica MeDIP es una herramienta susceptible de cribado, tanto en el de todo el genoma y el lugar específico de nivel 6, 7. Esta técnica proporciona una vista rápida de los niveles de metilación del ADN usando una cantidad limitada de partida de ADN y permite realizar comparaciones sencillas entre las diferentes fuentes. Aplicaciones posteriores de usar el producto MeDIP incluyen una variedad de microarrays como de todo el genoma y los arreglos de oligonucleótidos CpG isla, directo los ensayos de PCR para los loci de interés, así como la secuencia.
MeDIP ofrece un enfoque distinto para la detección de metilación del ADN que se basa en anticuerpos para distinguir el ADN metilado y unmethylated 6. Mientras MeDIP es más rápido que los enfoques tradicionales de secuenciación de bisulfito y no se limita al análisis de secuencias específicas, como el análisis de enzimas de restricción, la inmunoprecipitación se depende de la secuencia de ADN CpG incluida la densidad, la presencia de elementos repetitivos y la composición. Por lo tanto, los controles adecuados, como ocurre con todos los experimentos, son importantes para el análisis y la interpretación de los resultados MeDIP.
Hay varios pasos a través de la técnica MeDIP donde se debe tomar un cuidado especial. Estos incluyen: el uso de tubos de silicona para evitar la unión no específica de ADN a las paredes del tubo, la garantía de la fragmentación del ADN adecuado después de la sonicación, y asegurar que el ADN es totalmente desnaturalizado. Además, tenga en cuenta que la cuantificación del producto MeDIP sola hebra puede ser difícil porque hay una cantidad limitada de materiales y muchas de las técnicas comunes para estimar la cantidad de ADN, tales como espectrofotometría, funcionan mejor con ADN de doble cadena. Además, es importante observar las prácticas adecuadas de seguridad en el laboratorio en todo momento, especialmente cuando las sustancias cáusticas como el fenol se utilizan.
La técnica MeDIP también pueden ser modificadas en varias etapas. Es importante destacar que el protocolo se puede escalar hacia arriba o hacia abajo para permitir un mayor rendimiento, o el trabajo con muestras de tamaño limitado. Un enfoque alternativo de fragmentación, como el uso de enzimas de restricción (por ejemplo, Alu I digestión), reduce las necesidades de equipos, pero también puede introducir sesgos potencialmente limitar ADN bajar en algunas regiones. Como con cualquier otro enfoque, los resultados son mejores validado mediante un enfoque alternativo para la detección de metilación del ADN 1, 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Queremos agradecer a los miembros de la Brown y laboratorios de Lam por su participación en la crítica de este video y en el artículo. Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y la Michael Smith Fundación para la Investigación de la Salud.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb | Reagent | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
- Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
- Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
- Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
- Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
- Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
- Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
- Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
- Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
- Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
- Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).
