Summary
このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）のためのプロトコルを示しています。 MeDIPは、選択的に5 - メチルシトシン（抗- 5 MC）のための特異性を有する抗体を用いてゲノムDNAのサンプルからメチル化DNA断片を抽出する二日間の手順です。
Abstract
DNAのメチル化パターンの識別には、メチル化が遺伝子発現に大きな影響を持つことが知られているように、エピジェネティクスの研究では一般的な手順であり、通常の開発だけでなく、病気に関与している
Protocol
DNAの抽出および検体の調製
異なるさまざまなサンプル（培養細胞、新鮮なだけでなく、ホルマリン固定パラフィン包埋組織として冷凍）からDNAをMeDIPに使用することができます。このようなヒストンなどの関連蛋白質することなく、高度に精製されたDNAを使用することが重要です。それはDNAの定量と抗体の結合の両方を妨げることができるように、試料からできるだけ多くのRNAを除去することも重要です。 MeDIPのために使用されるDNAの量は200 ngから利用可能なDNAの量に応じて、1μgの範囲で指定できます。このプロトコルを示すために、1μgのDNAが使用されます。以下のプロトコールは、培養細胞から高品質の二本鎖DNAを提供します。他のプロトコルは、他の種類のサンプルからDNAの抽出に使用されるべきである。
- 1.7ミリリットルエッペンドルフチューブ中で細胞ペレットに消化緩衝液400μlを添加します。
- チューブにプロテイナーゼKの100μgを追加し、50℃一晩インキュベート℃、
- 500μlのフェノールのpH 7を追加し、反転によって穏やかに混和する。
- 室温で10分間13,000 gでスピン。
- 新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。
- 繰り返します一度3〜5を繰り返します。
- 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHが7を追加し、反転によって穏やかに混和する。
- 室温で10分間13,000 gでスピン。
- 新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。
- RNase Aを40μgを追加し、37℃で1時間のインキュベート℃に
- 500μlのフェノールのpH 7を追加し、反転によって穏やかに混和する。
- 室温で10分間13,000 gでスピン。
- 新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。
- 繰り返しは、かつて11〜13を繰り返します。
- 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHが7を追加し、反転によって穏やかに混和する。
- 室温で10分間13,000 gでスピン。
- 新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。
- の3 M酢酸ナトリウム（40μl）を10分の1の体積を加え、よく混ぜる。
- 100％エタノールの2倍量（900μl）を追加し、20分、-20 ° Cでよく混ぜ、そして場所。
- 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、
- エタノールを削除する、パルスのスピン、そして残留エタノールを除去します。
- 洗浄に500μlの冷70％エタノールを加えます。 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、
- 70％エタノール、パルスのスピンを削除し、ピペッティングにより残留エタノールを除去します。
- 空気が残留エタノールの痕跡をすべて削除するには、室温で10分のためのオープンキャップでペレットを乾燥させます。
- 4℃で一晩滅菌dH2Oの50μlの再懸濁し、DNA℃の
- 光度計分光光度計を用いてDNAを定量化する。 260：1.8の280比率が理想的です。
- 100 bpのラダーをアガロースゲル上でDNAの品質とサイズの範囲を決定します。ゲノムDNAのわずか10 ngのは、SYBRゴールドのようなDNAの少量に非常に敏感な色素を用いて染色を1.7パーセントアガロースゲル上で実行することができます。
- サンプルごとにシリコン処理したチューブに、滅菌のdH 2 Oで構成されたボリュームの残りの50μlの合計体積で1μgのDNAを準備する
DNA超音波処理
DNAの超音波処理とMeDIPのプロトコルは、管壁へのタンパク質の非特異的結合を防ぐためにsiliconziedチューブで実行する必要があります。 DNAサンプル用に最適な超音波処理時間は、ゲル電気泳動（ステップ27）から決定されたDNAサンプルの断片化の程度に基づいています。例えば、培養細胞から抽出したDNAは非常に高分子量でなければならない、と続いて、しばしば部分的に分解されるアーカイブのサンプルから抽出したDNAよりも多くの超音波処理が必要になります。サンプルが均一に高分子量のものであるなら、それは個別に各サンプルを確認することなく、このプロトコルで説明されているように超音波処理を続行するには、この時点で合理的です。サンプルはアーカイブのサンプルと同様に断片化されている場合、それは300 - 100ベーシスポイントのフラグメントを得るために超音波処理時間を減少させることによって可能性が高い超音波処理の手順を適応させるために必要となります。あなたが部分的に分解されているサンプルを処理することが予想される場合は、超音波処理パラメータの最適化は重要なものから代表的なサンプルで実行することができます。ゲル電気泳動（ステップ27）から観測されたDNA断片化の程度に基づいて、実験者はサンプルのために最適な超音波処理の時間を事前に決定することができます。ここでは、高分子量のDNAを用いて自動化された超音波処理装置（DiagenodeのBioruptor、UCD - 200 TM）と超音波処理によって約300〜1,000 bpのDNA断片を取得する方法を説明します。
- Biorupterの水は4でなければなりません℃に
- 自動設定で7分（30秒、最大パワーで30秒オン、オフ）のために超音波処理。
- 免疫沈降（IP）反応のためにシリコーン1.7ミリリットルの遠心管に超音波処理した製品や場所、800 ngの（40μl）を取り外します。
- 入力として機能するように、残りの200 ngの（10μl）を（IN）（4℃で保存）リファレンスDNAを脇に置きます。
メチル化DNAのIMMUNOPRECIPITATON
- 水浴中で10分間95℃でIP反応（800 ng）のために使用されるDNAを変性させる。
- 氷上で直ちに冷却してください。次のステップに進む前に（氷の上で約5分）完全にDNAを冷ます。
- 5μgのモノクローナル抗体を追加。
- 500μlの最終容量にIPバッファを（このプロトコルを通じて、室温で使用される）を追加します。
- チューブホルダーを回転で4で2時間℃でインキュベートする。
- 手順5が完了する直前に、（ステップ6-11）洗浄してダイナビーズを準備。最初に、ボルテックスでバイアルに徹底的にビーズを懸濁します。
- 新しいシリコーンチューブ（例えば、8の反応を行う場合、9の十分なビーズを除去する、すなわち、270μL）に、反応プラス1あたりの再懸濁したダイナビーズ30μlを（〜2 × 10 7）転送する。
- 室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。
- 上清をピペットで。上清を除去する際、ピペットの先端で内部の壁（ビーズが磁石に引き付けている）に対して、ビーズには手を触れないでください。
- 磁石からチューブを外し、IPバッファの過剰量（750μlの- 1000μL）でビーズを再懸濁します。バック室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。
- 一回以上の洗浄を繰り返し、次にステップ7で取り外した元のボリュームにIPバッファーで洗浄したビーズを再懸濁します。
- 各IP反応液に洗浄ダイナビーズ30μlを追加する
- 4℃で2時間回転管ホルダー℃でインキュベートする
- インキュベーションが完了した後、室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。
- 上清をピペットで。ピペットの先端でチューブの内壁を（ビーズが磁石に引き付け場所）には触れないでください。 IP緩衝液500μlを追加。チューブの内容物を混合し、2分のための磁気ラックに戻す。 500μlのIPバッファーで1回洗浄繰り返します。
- 最後の洗浄上清を除去した後、消化バッファ400μlでビーズを再懸濁します。
- プロテイナーゼK100μgのとの反応を治療し、50℃で一晩インキュベート℃、
免疫沈降したDNAの精製
- 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHを7と完全にボルテックスを追加。
- 室温で10分間13,000 gでスピン。
- 新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。
- 水溶液と有機層との間の相間が曇って表示されている場合は手順1〜3を繰り返します。
- 1 / 10量の3 M酢酸ナトリウム（40μl）を、ボルテックスを追加。
- 1グリコーゲンの溶液（20μg/μLの）と渦を追加。
- 100％エタノール、渦、および20分まで-20℃での場所の2倍量（1000μL）を追加します。
- 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、
- エタノールを削除する、パルスのスピン、そして残留エタノールを除去します。
- 洗浄に500μlの冷70％エタノールを加えます。 4℃で20分間13,000 gで軽くボルテックスし、そしてスピン℃に
- 70％エタノール、パルスのスピンを削除し、ピペッティングにより残留エタノールを除去します。
- 空気が残留エタノールの痕跡をすべて削除するには、室温で10分のためのオープンキャップでペレットを乾燥させます。
- のdH 2 0滅菌10μlに再懸DNAペレット。
PCRによる検証
- あなたのMeDIPの手順は通常のヒトDNAを（男性または女性）を使用してMeDIPのプロトコルを実行することにより、ワーキング、その後、メチル化に富むことが知られている地域をアッセイしていることを確認するためにテストすることができます。
- PCRチューブにMeDIPの製品の30％、および他のPCRチューブにMeDIP製品の別の30％を削除します。
- PCRチューブにDNAの10ngの、および他のPCRチューブにDNA中の10 ngを置く。これで、4つの別々のPCR反応をセットアップする必要があります。
- PCRは、H19とCTRLプライマーを用いて行うには、表1に示した。
- 表2に示すように12.5μL、総体積とのPCR反応の2つのmastermixes（各プライマーセットで1つずつ）を用意。
- 表3に記載された条件を用いてPCRをThermocycle。
- 可視化のための2％アガロースゲルでPCR産物の5μlを実行します。
- 成功MeDIPの予想結果を表4に示す。
テーブル
表1：H19とPCRの検証のためにCTRLプライマー。
プライマーセット フォワードプライマー リバースプライマー 予想される製品のサイズ H19 H19_F 5' - cgagtgtgcgtgagtgtgag H19_R 5' - ggcgtaatggaatgcttgaa 174 bpの CTRL（コントロール） CTRL_F5' - gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5' - gttcctcagacagccacattt 139 bpの 表2。 PCR反応のMastermixes。
H19ミックス（あたりRXN） CTRLミックス（あたりRXN） 6.875 6.875 10Xバッファー 1.25 1.25 dNTPミックス（10 mMの各） 0.25 0.25 のMgCl 2（50mMの） 0.25 0.25 プライマー（H19_F / RまたはCTRL_F / R）（10μMの各F / R） 0.625 0.625 プラチナTaqポリメラーゼ 0.25 0.25 表3。 PCR thermocyling条件。
95 ° C 5時00 40X 95 ° C 0時30分 56℃ 0時30分 72 ° C 0時15分 表4。成功MeDIPのPCRの結果を期待。
テンプレートDNA 使用するプライマー IN IP H19 正 正 CTRL 正 マイナス
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Discussion
疾患において重要な役割のDNAメチル化の戯曲の認識が広がりつつあります、この修正を測定するアッセイのため、開発は13、12、3重要性を増してきています。 MeDIP技術は、全ゲノムと遺伝子座特異的レベル6、7の両方でのスクリーニングのための従順なツールです。この手法は、DNAを始めるの限られた量を使用してDNAのメチル化レベルの急速なビューを提供し、異なるソース間で容易に比較することができます。 MeDIPの製品を使用して、ダウンストリームのアプリケーションは、そのような全ゲノムおよびCpGアイランドのオリゴヌクレオチドの配列としてマイクロアレイの様々な、興味のある遺伝子座の直接PCRアッセイだけでなく、シーケンシングなどがあります。
MeDIPはメチル化とDNA 6を非メチル化を区別する抗体に依存しているDNAのメチル化の検出に異なるアプローチを提供します。 MeDIPは従来の亜硫酸塩シークエンシングの手法よりも高速であり、それは制限酵素分析のような特異的な配列の解析に限定されないが、免疫沈降は、CpG密度、反復的な要素の有無や組成を含むDNA配列に依存することになります。このように、適切なコントロールは、すべての実験と同様に、MeDIP結果の分析と解釈に重要である。
余分な注意を払う必要がMeDIP技術を通して、いくつかのステップがあります。超音波処理後のDNAの十分な断片化を確保すること;管壁へのDNAの非特異的結合を防ぐために、シリコナイズチューブの使用をし、そのDNAを確保することは完全に変性している：これらは含まれています。さらに、材料や分光光度計などのDNA量を推定するための多くの一般的なテクニックの限られた量があるので、一本鎖MeDIP製品の定量化が困難である場合がありますので、二本鎖DNAに最適です。さらに、フェノール等の腐食性物質が使用されている場合は特に、常に適切な実験室の安全対策を遵守することが重要です。
MeDIPの技術はまた、いくつかの手順で変更することができます。重要なのプロトコルは、限られたサンプルサイズと歩留まり、または作業をできるように拡大または縮小することができます。このような制限酵素の使用（例： アルミ I消化）などの代替断片化のアプローチは、機器の要件を軽減するだけでなく、潜在的にDNAは、一部の地域ではプルダウン制限バイアスを導入することができます。どのようなアプローチと同様に、結果が最適なDNAメチル化の検出1、14に別のアプローチを使用して検証されます。
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Acknowledgments
我々は、このビデオと記事を批評への参加のためにブラウンとラムラボのメンバーに感謝したい。この作品は、健康研究と健康研究のためのマイケルスミス財団のためのカナダの協会からの資金によって支えられている。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb | Reagent | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
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