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Biology

Imunoprecipitação DNA metilado

doi: 10.3791/935 Published: January 2, 2009
* These authors contributed equally

Summary

Este vídeo demonstra o protocolo para imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP). MEDIP é um procedimento dois dias que, seletivamente, extratos de fragmentos de DNA metilado partir de uma amostra do DNA genômico utilizando anticorpos com especificidade para 5-metilcitosina (anti-5 mC).

Abstract

A identificação de padrões de metilação do DNA é um procedimento comum no estudo da epigenética, como a metilação é conhecido por ter efeitos significativos sobre a expressão gênica, e está envolvida com desenvolvimento normal, bem como doença

Protocol

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EXTRAÇÃO DE DNA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

DNA de uma variedade de diferentes amostras (células cultivadas fresca, congelada, bem como tecidos fixados em formalina incluído em parafina) podem ser usados ​​para MEDIP. É importante o uso de DNA altamente purificado, sem proteínas associadas, tais como histonas. Também é importante para remover RNA, tanto quanto possível a partir da amostra, como ele pode interferir tanto com a quantificação de DNA e ligação aos anticorpos. A quantidade de DNA usado para MEDIP pode variar de 200 ng de 1 mg, dependendo da quantidade de DNA disponíveis. Para demonstrar este protocolo, 1 mg de DNA será usado. O seguinte protocolo irá proporcionar alta qualidade do DNA fita dupla a partir de células cultivadas. Outros protocolos devem ser empregados para a extração de DNA de tipos de amostra outro.

  1. Adicionar 400 mL de tampão de digestão para um pellet de células em um tubo Eppendorf 1,7 ml.
  2. Adicionar 100 mg de proteinase K para o tubo e incubar durante a 50 ° C.
  3. Adicionar 500 mL de fenol pH 7 e misturar suave mas completamente por inversão.
  4. Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente.
  5. Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo.
  6. Repita as etapas 3 a 5 uma vez.
  7. Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e misturar suave mas completamente por inversão.
  8. Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente.
  9. Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo.
  10. Adicionar 40 mg de RNase A e incubar 1 hora a 37 ° C.
  11. Adicionar 500 mL de fenol pH 7 e misturar suave mas completamente por inversão.
  12. Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente.
  13. Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo.
  14. Repita as etapas 11 a 13 uma vez.
  15. Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e misturar suave mas completamente por inversão.
  16. Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente.
  17. Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo.
  18. Adicionar volume 1/10th 3 M acetato de sódio (40 mL) e misture bem.
  19. Adicionar 2 volumes (900 L) de etanol 100%, misture bem e coloque a -20 ° C por 20 minutos.
  20. Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C.
  21. Remover o etanol, spin pulso, e remover o etanol residual.
  22. Adicionar 500 mL de etanol frio a 70% de lavar. Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C.
  23. Remover o etanol 70%, giro de pulso, e remover o etanol residual por pipetagem.
  24. O ar seco do sedimento com a tampa aberta por 10 minutos em temperatura ambiente para remover todos os vestígios do etanol residual.
  25. Ressuspender o DNA em 50 ul de dH2O esterilizado durante a noite a 4 ° C.
  26. Quantificar o DNA utilizando um Espectrofotômetro NanoDrop. Um A 260: Uma relação de 280 de 1.8 é ideal.
  27. Determinar a qualidade do DNA e faixa de tamanho em um gel de agarose com 100 bp ladder. Tão pouco como 10 ng de DNA genômico pode ser executado em um gel de agarose 1,7% seguido de coloração com um corante que é altamente sensível a pequenas quantidades de DNA, tais como ouro SYBR.
  28. Em um tubo siliconizado por amostra, prepare 1 mg de DNA em um volume total de 50 l com o restante do volume composto esterilizado com dH 2 O.

DNA sonicação

DNA sonicação eo protocolo MEDIP deve ser realizada em tubos siliconzied para evitar a ligação específica de proteínas não às paredes do tubo. Vezes sonicação ideal para as amostras de DNA são baseados no grau de fragmentação da amostra de DNA determinado a partir de eletroforese em gel (Passo 27). Por exemplo, o DNA extraído de células em cultura deve ser de muito alto peso molecular, e, posteriormente, exigir mais do que sonicação DNA extraído de amostras de arquivo que são muitas vezes parcialmente degradada. Se as amostras são de uniformemente elevado peso molecular, é razoável neste momento a proceder à sonicação, conforme descrito neste protocolo sem verificar cada amostra individualmente. Se as amostras são fragmentados com amostras de arquivo, será necessário adaptar o procedimento de sonicação provavelmente por diminuir os tempos de sonicação para obter 300-100bp fragmentos. Se você esperar para processar as amostras que são parcialmente degradadas, otimização de parâmetros de sonicação pode ser realizada em uma amostra representativa daqueles de interesse. Com base no grau de fragmentação do DNA observados de eletroforese em gel (Passo 27), o experimentador pode predeterminar o tempo de sonicação ideal para a amostra. Aqui nós descrevemos um método para obter 300-1000 fragmentos de DNA bp por sonicação com um dispositivo automatizado sonicando (Bioruptor de Diagenode, UCD-200 TM) usando DNA de alto peso molecular.

  1. Água em Biorupter deve ser a 4 ° C.
  2. Sonicate por 7 minutos em configurações automáticas (30 seg em 30 seg off à potência máxima).
  3. Remover 800 ng (40 L) de produto sonicado e colocar em tubo de centrífuga siliconizado 1,7 ml para a imunoprecipitação (IP) da reação.
  4. Retiradas restantes ng 200 (10 ml) para servir como entrada (IN) de ADN de referência (loja a 4 ° C).

    IMMUNOPRECIPITATON de DNA metilado

    1. Desnaturar o DNA que será usado para a reação IP (800 ng) a 95 ° C por 10 minutos em banho-maria.
    2. Arrefecer imediatamente no gelo. Deixe esfriar completamente DNA (aproximadamente 5 minutos no gelo) antes de prosseguir com o próximo passo.
    3. Adicionar 5 mg de anticorpos monoclonais.
    4. Adicionar tampão IP (usado em temperatura ambiente durante todo este protocolo) para um volume final de 500 mL.
    5. Incubar por 2 horas a 4 ° C na rotação titular tubo.
    6. Pouco antes de o passo 5 está completa, prepare Dynabeads por lavagem (Passos 6-11). Em primeiro lugar, voltar a suspender as contas completamente dentro do frasco em vortex.
    7. Transferência de 30 mL (~ 2 x 10 7) de Dynabeads ressuspenso por reação mais 1, em um novo tubo siliconizado (por exemplo, se fazendo 8 reações, remova contas suficiente para 9, ou seja, 270 mL).
    8. Colocar o tubo na cremalheira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente.
    9. Pipeta fora do sobrenadante. Quando retirar o sobrenadante, evite tocar os grânulos contra a parede interna (onde as contas atrair para o ímã) com a ponta da pipeta.
    10. Remova o tubo do ímã, e ressuspender as contas em um excesso de volume de tampão IP (750 mL mL-1000). Colocar o tubo de volta na prateleira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente.
    11. Repita o lava mais uma vez, e depois voltar a suspender as contas lavados em tampão IP no volume original removidos na Etapa 7.
    12. Adicionar 30 mL de Dynabeads lavada para cada reação IP
    13. Incubar em um suporte de tubo rotativo durante 2 horas a 4 ° C.
    14. Após a incubação estiver concluída, coloque o tubo na cremalheira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente.
    15. Pipeta fora do sobrenadante. Evite tocar a parede interior do tubo (onde as contas atrair para o ímã) com a ponta da pipeta. Adicionar 500 mL de tampão IP. Misture o conteúdo do tubo e colocá-lo de volta na prateleira magnética por 2 minutos. Repita lave com 500 ul de buffer IP uma só vez.
    16. Após a remoção do sobrenadante da última lavagem, ressuspender as contas em 400 mL de tampão de digestão.
    17. Tratar a reação com 100 mg de Proteinase K e incubar durante a 50 ° C.

    PURIFICAÇÃO DE DNA IMMUNOPRECIPITATED

    1. Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e vortex completamente.
    2. Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente.
    3. Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo.
    4. Repita as etapas 1 a 3 se a interfase entre as camadas aquosa e orgânica parece nublado.
    5. Adicione 1 / 10 º volume 3 M acetato de sódio (40 mL) e vortex.
    6. Adicionar 1 ml de glicogênio (20 mcg / mL) e vortex.
    7. Adicionar 2 volumes (1000 L) de etanol 100%, vortex, e coloque a -20 ° C por 20 minutos.
    8. Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C.
    9. Remover o etanol, spin pulso, e remover o etanol residual.
    10. Adicionar 500 mL de etanol frio a 70% de lavar. Brevemente Vortex, e giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C.
    11. Remover o etanol 70%, giro de pulso, e remover o etanol residual por pipetagem.
    12. O ar seco do sedimento com a tampa aberta por 10 minutos em temperatura ambiente para remover todos os vestígios do etanol residual.
    13. Ressuspender DNA sedimento em 10 ml esterilizados dH 2 0.

    Validação por PCR

    1. Você pode testar para garantir que o seu procedimento MEDIP está funcionando, a execução do protocolo MEDIP usando DNA humano normal (masculino ou feminino) e, posteriormente, assaying uma região conhecida por ser enriquecido para metilação.
    2. Remover 30% do produto MEDIP ao tubo de PCR, e outros 30% do produto MEDIP para outro tubo de PCR.
    3. Colocar 10 ng de DNA IN em um tubo de PCR, e 10 ng de DNA IN em outro tubo de PCR. Você deve ter agora quatro reações distintas PCR para configurar.
    4. Realizar PCR usando primers H19 e CTRL como indicado na Tabela 1.
    5. Prepare duas mastermixes (um para cada conjunto de primers) para reações de PCR com 12,5 mL de volume total, como descrito na Tabela 2.
    6. Thermocycle do PCR usando as condições descritas na Tabela 3.
    7. Correr 5 mL de produtos de PCR em um gel de agarose 2% para visualização.
    8. Os resultados esperados para MEDIP sucesso são apresentados na Tabela 4.

    Tabelas

    Tabela 1: H19 e CTRL primers para a validação de PCR.

    Definir Primer Primer para a frente Primer reverso Tamanho do produto antecipado
    H19 H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa 174 bp
    CTRL (controle) CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt 139 bp

    Tabela 2. Mastermixes para as reações PCR.

    2 O DDH
    H19 Mix (por Rxn) CTRL Mix (por Rxn)
    6,875 6,875
    Tampão 10X 1,25 1,25
    dNTP mix (10 mM cada) 0,25 0,25
    MgCl 2 (50 mM) 0,25 0,25
    Primers (H19_F / R ou CTRL_F / R) (10 mM cada F / R) 0,625 0,625
    Taq Platinum 0,25 0,25

    Tabela 3. Condições de PCR thermocyling.

    95 ° C 05:00
    40X
    95 ° C 00:30
    56 ° C 00:30
    72 ° C 00:15

    Tabela 4. Resultados esperados para o MEDIP PCR bem sucedido.

    DNA modelo
    Primer usados IN IP
    H19 Positivo Positivo
    CTRL Positivo Negativo

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Discussion

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Há uma consciência crescente do papel significativo desempenha na doença de metilação do DNA, portanto, o desenvolvimento de ensaios para medir esta modificação estão se tornando cada vez mais importante 3, 12, 13. A técnica MEDIP é um instrumento favorável para triagem, tanto do genoma inteiro-o e locus específico de nível 6, 7. Esta técnica oferece uma visão rápida dos níveis de metilação do DNA usando quantidades limitadas de partida DNA e permite comparações fáceis entre diferentes fontes. Aplicações a jusante de usar o produto MEDIP incluem uma variedade de microarrays, como genoma inteiro e arrays de oligonucleotídeos CpG ilha, ensaios diretos PCR para loci de interesse, bem como o seqüenciamento.

MEDIP fornece uma abordagem distinta para detecção de DNA de metilação que depende de anticorpos para distinguir metilado e não metilado de DNA 6. Enquanto MEDIP é mais rápido do que as abordagens tradicionais bissulfito seqüenciamento e não se limita à análise de seqüências específicas como análise de enzimas de restrição, a imunoprecipitação será dependente da seqüência de DNA incluindo densidade CpG, a presença de elemento repetitivo e composição. Assim, controles adequados, como com cada experiência, são importantes para a análise e interpretação dos resultados MEDIP.

Há várias etapas ao longo do MEDIP técnica onde os cuidados extras devem ser tomados. Estes incluem: o uso de mangueiras siliconizadas para prevenir não-específicos de ligação a DNA às paredes do tubo, assegurando adequada fragmentação do DNA após sonicação e garantir que o DNA é completamente desnaturado. Além disso, note que a quantificação de single-stranded MEDIP produto pode ser difícil porque há uma quantidade limitada de materiais e muitas técnicas comuns para estimar a quantidade de DNA, tais como espectrofotometria, funcionam melhor com double-stranded DNA. Além disso, é importante observar as práticas de segurança adequada de laboratório em todos os momentos, especialmente quando substâncias cáusticas, tais como fenol são utilizados.

A técnica MEDIP também podem ser modificados em várias etapas. Importante é que o protocolo pode ser escalado para cima ou para baixo para permitir maiores rendimentos, ou trabalhar com tamanhos de amostra limitada. Uma abordagem alternativa fragmentação, tais como o uso de enzimas de restrição (por exemplo, a digestão Alu I), reduz as necessidades de equipamento, mas também pode introduzir vieses potencialmente limitando DNA puxar para baixo em algumas regiões. Como acontece com qualquer abordagem, os resultados são melhores validado usando uma abordagem alternativa para detecção de DNA de metilação 1, 14.

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Acknowledgments

Queremos agradecer aos membros do Brown e laboratórios Lam pela sua participação na crítica a este vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research eo Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Biorupter sonicator Tool Diagenode UCD-200 TM
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes Other Sorenson BioScience 11510
ND 3300 Spectrophotometer Tool NanoDrop
Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb Reagent Calbiochem 162 33 D3
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG Reagent Invitrogen 112-01D
Magnetic Tube Rack Tool Invitrogen CS15000
Mini LabRoller Tool Labnet International H5500
IP Buffer 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature
Digestion Buffer 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl

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References

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Thu, K. L., Vucic, E. A., Kennett, J. Y., Heryet, C., Brown, C. J., Lam, W. L., Wilson, I. M. Methylated DNA Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (23), e935, doi:10.3791/935 (2009).More

Thu, K. L., Vucic, E. A., Kennett, J. Y., Heryet, C., Brown, C. J., Lam, W. L., Wilson, I. M. Methylated DNA Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (23), e935, doi:10.3791/935 (2009).

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