Summary
Ceci est conçu comme une introduction à l'enregistrement de patch clamp à partir d'ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l'enlèvement membrane vitelline, la formation d'un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.
Abstract
Depuis son développement en Sakmann et Neher 1, 2, le patch-clamp s'est imposé comme une technique extrêmement utile pour la mesure électrophysiologique des canaux ioniques uniques ou multiples dans les cellules. Cette technique peut être appliquée aux canaux ioniques, tant dans leur environnement natif et exprimé dans des cellules hétérologues, tels que des ovocytes récoltés à partir de la grenouille africaine griffes, Xenopus laevis. Ici, nous décrivons la technique bien établie de l'enregistrement de patch-clamp à partir d'ovocytes de Xénope. Cette technique est utilisée pour mesurer les propriétés des canaux ioniques exprimés soit au sein des populations (macropatch) ou individuellement (un seul canal d'enregistrement). Nous nous concentrons sur les techniques pour maximiser la qualité de la préparation des ovocytes et la génération de phoque. Avec tous les facteurs optimisée, cette technique donne une probabilité de succès au cours de génération d'étanchéité 90 pour cent. Le processus peut être optimisé différemment par chaque chercheur sur la base des facteurs qu'il ou elle trouve le plus important, et nous présentons la démarche qui ont conduit à la plus grande réussite dans nos mains.
Protocol
Partie 1: Retrait de la membrane vitelline
- Préparer deux séries de pinces. Nous préférons n ° 5 pinces, où un ensemble a été légèrement taillé avec un fichier. Préparez aussi une pipette de transfert en verre par parage et polissage au feu un 7 "pipette Pasteur.
- Recommandé: Pour prévenir les ovocytes de glisser, couper un cercle de grille (carrés de 1 mm) et de la colle dans le fond d'un plat de Pétri 60mm. Ce plat peut être réutilisé indéfiniment si maintenu propre entre deux utilisations.
- Remplissez la boîte de Pétri avec une solution à mi-chemin hyperosmotiques (voir recette) et placer sous un microscope à dissection.
- Retirer 1-3 ovocytes de Xenopus de leur solution d'incubation avec une pipette Pasteur polie et le placer dans le plat.
- Attendre 15s - 2 min pour les cellules de commencer à se rétrécir. Des temps plus longs rendent les cellules plus faciles à peler; réduction des délais de cellules saines pour patcher.
- Comme les cellules se rétrécit, la membrane vitelline va commencer à devenir à peine visible comme une couche transparente sur la cellule. Sélectionnez une cellule saine (sans verticilles ou défauts) pour peler.
- Avec une paire de pince, pincez doucement la membrane vitelline, sans endommager la membrane plasmique. Avec l'autre, saisir près au même endroit et doucement déchirer la membrane claire et libre en dehors de la cellule.
- Avec la pipette Pasteur, soigneusement déplacer la cellule vers la chambre d'enregistrement. Notez que la cellule va être fragile après le retrait vitelline.
Partie 2: génération Gigaseal
- Remplir une pipette d'enregistrement avec une solution saline. Utilisez le volume minimal de solution qui permet un bon contact électrique avec le fil électrode afin de minimiser la capacité pipette.
- Flick la pipette plusieurs fois pour permettre aux bulles à flotter et glisser sur le fil électrode.
Appliquer une pression à la pipette remplie. Cela peut être fait par la bouche ou avec une pompe d'aquarium dans une animalerie. Cette pression est essentiel pour maintenir la pipette nettoie comme il traverse l'interface liquide et se déplace à la cellule. - Trouvez l'ovocyte dans la chambre et de se concentrer fortement sur le bord de la cellule.
- Avec la pipette de la baignoire, le centre de la pointe (hors foyer) au-dessus de la cellule. Cette fois-ci minimise passé dans le bain avant la génération de phoque.
- Baisse de la pipette vers le bas dans la prochaine mise au point nette à la cellule. Le mettre en proximité (~ 50 microns). Vous devriez voir une petite distorsion de solution poussé hors de la pipette par la pression.
- Utilisation du logiciel de patch-clamp, vérifier la résistance de la pipette (notre but est d'environ 3-4 MQ) et zéro le courant en utilisant la tension de décalage.
- Avec une pression positive sur la pipette, déplacer la pointe lentement vers la cellule tout en surveillant la résistance visuellement ou en utilisant un moniteur audio qui génère un signal dont la fréquence est proportionnelle à la résistance. Comme la pointe commence à toucher la cellule, la résistance va augmenter.
- Soudain, mais doucement basculer du positif au négatif de la pression d'environ la même valeur absolue. Résistance devrait augmenter pour sceller la formation.
- La plupart du temps, la formation de joint se produit en quelques secondes, parfois 30-60 secondes sont nécessaires.
- Une fois que la résistance est à 1GΩ, la pression peut être libérée à neutre. Vous avez maintenant un patch sur les cellules. Pour un patch à l'envers, tirez hors de la cellule rapidement. Pour l'extérieur-out, voir ci-dessous.
Partie 5: Hors-out topologie (facultatif)
- Immédiatement après la réalisation d'un gigaseal, la rupture de la membrane. Cela peut être fait avec aspiration forte, mais nous préférons une impulsion de 1 V pour 1 ms. La résistance devrait tomber à un peu plus de la résistance pipette initiale.
- Déplacer la pipette hors de la cellule lentement et en douceur. Vous devriez voir une section de la traction cellule avec la pipette. Soudain, et au sein de quelques secondes, la cellule se cassera le dos et la résistance doivent immédiatement et simultanément retour à GΩs.
- Vous avez maintenant un patch dans la configuration hors-out. Le ectodomaines de tout les canaux ioniques inclus est exposé à la baignoire.
Partie 6: Résultats prévus
Généralement, les joints de résistance plus élevées sont préférables et plus vivaient. 10 GQ est un bon guide pour la haute qualité des joints. Dans notre expérience, les chances d'obtenir des joints de cette qualité varie en fonction de nombreux facteurs, notamment la cellule et la pipette de qualité. Taux d'acquisition patch peut être plus de 95% avec des cellules saines, des pipettes propre, et un chercheur expérimenté. Ces correctifs peuvent durer pendant plusieurs minutes et sont adaptés à toute étude électrophysiologique des canaux ioniques exprimés dans des ovocytes de Xenopus, y compris les enregistrements mono-canal.
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Discussion
Il ya de nombreux paramètres d'enregistrement électrophysiologiques pas discuté ici. Configuration Rig, la gestion du bruit du système, l'expression de canaux, et des protocoles d'enregistrement sont tous également critique pour de bons résultats expérimentaux.
Dans notre expérience, ce sont les paramètres les plus critiques pour la formation de joints d'étanchéité fiable: ovocytes de grande qualité, en enlevant la membrane vitelline rapidement (aka, «peeling»), utiliser des pipettes nouvellement tiré protégé de la poussière, des pipettes en douceur, la pression positive appliquée à l'entrée du bain solution, parfois brièvement dans le bain avant le scellement. Ceci étant dit, l'expérience est très variable et les autres ont leurs propres ensembles de la plupart des facteurs importants.
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Acknowledgments
Recette de solution de rétrécissement est du laboratoire de RW Aldrich. Nous remercions les organismes de financement et fondations suivantes pour le soutien: National Institutes of Health, National Science Foundation, l'American Heart Association, la Muscular Dystrophy Association, le B. Donald E. Baxter et Delia Fondation, le Fonds de dotation et les Klingenstein McKnight for Neuroscience.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
