Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

Summary

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Abstract

Sakmann 및 Neher ^{1, 2에} 의해 개발 이후, 패치 클램프 세포에서 하나 또는 여러 개의 이온 채널의 electrophysiological 측정을위한 매우 유용한 기술로 설립되었다. 이 기술들은 기본 환경 모두에서 이온 채널에 적용 및 아프리카 발톱 개구리, Xenopus laevis oocytes에서 수확으로 heterologous 세포에 표현할 수있다. 여기, 우리는 Xenopus의 oocytes에서 패치 클램프 녹음의 잘 설립 기법을 설명합니다. 이 기술은 개별적으로 인구 (macropatch) 또는 (단일 채널 녹음)에 어느 표현 이온 채널의 속성을 측정하는 데 사용됩니다. 우리는 oocyte 준비 및 인감 세대의 품질을 극대화하기 위해 기술에 중점을두고 있습니다. 모든 요소가 최적으로,이 기법은 90 % 이상 성공 인감 세대의 가능성을 제공합니다. 과정은 그 또는 그녀가 가장 중요한 발견 요인에 따라 모든 연구자가 다르게 최적화, 우리는 우리 손에 가장 큰 성공으로 이어질있는 방법을 제시 수도 있습니다.

Protocol

1 부 : vitelline 막 제거

1. 포셉 두 세트를 준비합니다. 우리는 한 세트가 약간 파일을 날카롭게되어 제 5 포셉를 선호합니다. 또한 7 "파스퇴르 피펫을 트리밍하고 불을 연마하여 유리 전송 피펫을 준비합니다.
2. 추천 : 늑대의 oocytes을 방지하기 위해, 그리드의 서클 (1mm의 사각형)을 잘라 60mm 페트리 접시의 바닥에 접착제. 사용하는 사이에 청소 보관하면이 음식은 무기한으로 활용할 수 있습니다.
3. 해부 현미경 hyperosmotic 솔루션 (제조법 참조) 장소 중간 페트리 접시를 채우십시오.
4. 그릇에 광택 파스퇴르 피펫과 장소와 함께 자신의 인큐베이션 솔루션 1-3 Xenopus의 oocytes를 제​​거합니다.
5. 정 잠깐 만요 - 전지 2 분을 축소하기 시작합니다. 긴 시간은 껍질에 세포가 쉽게, 짧은 시간이 패치에 대한 건강한 세포로 이어집니다.
6. 셀 축소로 vitelline 막의 세포 위에 투명한 레이어로 거의 표시되기 시작합니다. 필링에 대한 건강한 세포 (whorls 또는 결함없이)를 선택합니다.
7. 포셉 한 쌍의로 부드럽게 플라즈마 막을 손상시키지 않고 vitelline 막를 파악. 다른과 함께 같은 장소 근처에 파악하고 부드럽게 떨어져 맑은 멤브레인 찢어하고 세포의 무료입니다.
8. 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 녹화 실로 셀 이동합니다. 셀 vitelline 제거 후 연약됩니다.

2 부 : Gigaseal 세대

1. 식염수에 기록 피펫을 입력합니다. 피펫 커패시턴스를 최소화하기 위해 전극 와이어 잘 전기적 접촉을 만드는 솔루션의 최소 볼륨을 사용합니다.
2. 거품이 전극 와이어에 부동 및 슬라이드 수 있도록 피펫 여러 번 버려.
   채워진 피펫에 압력을 적용합니다. 이것은 입이나 애완 동물 가게에서 수족관 펌프로 할 수 있습니다. 이 압력은 액체 인터페이스와 세포로 이동을 교차으로 피펫은 청소 유지하는 것이 중요합니다.
3. 챔버에서 oocyte를 찾아 세포의 가장자리에 크게 중점을두고 있습니다.
4. 목욕, 중심 세포 위에 (초점) 팁 밖으로 피펫으로. 이 최소화 시간은 인감 생성하기 전에 욕조에 보냈습니다.
5. 셀 옆에 선명하게 피펫을 드롭 다운. 근접 (~ 50 미크론)로 가져와. 이 솔루션의 작은 변형이 다시 압력에 의한 피펫 밖으로 밀려납니다.
6. 패치 클램프 소프트웨어를 사용하여 피펫의 저항을 확인 (우리의 목표는 약 3-4 MΩ입니다)와 오프셋 전압을 사용하여 전류를 제로.
7. 시각 저항을 모니터링이나 주파수 저항에 비례하는 음색을 생성 오디오 모니터를 사용하면서 피펫에 긍정적인 압력으로, 세포쪽으로 천천히 팁을 이동합니다. 팁이 세포를 만져 시작으로, 저항은 증가합니다.
8. 갑자기하지만 부드럽게 거의 동일한 절대값의 부정적인 압력에 긍정에서 전환합니다. 저항이 형성 밀봉을 증가한다.
9. 시간의 대다수는, 인감 형성은 몇 초 이내에 발생, 가끔 30-60초이 필요합니다.
10. 저항 1GΩ에되면, 압력은 중립에 공개하실 수 있습니다. 이제 온 세포 패치를했습니다. 내부 아웃 패치, 빠르게 세포에서 멀리 당기십시오. 외부 출력은 아래를 참조하십시오.

제 5 부 : 외부 아웃 토폴로지 (옵션)

1. 즉시 gigaseal, 파열 멤브레인 달성 후. 이것은 날카로운 흡입과 함께 할,하지만 우리가 한 MS에 1 V 펄스를 선호하실 수 있습니다. 저항은 초기 피펫의 저항보다 약간 더 많은 드롭한다.
2. 멀리 천천히, 그리고 부드럽게 세포에서 피펫을 이동합니다. 당신은 피펫으로 세포 당겨의 섹션을 참조해야합니다. 갑자기, 그리고 몇 초 이내에, 세포는 다시 스냅되고 저항은 즉시 동시에 GΩs로 돌아합니다.
3. 이제 외부 출력 구성에 패치를했습니다. 모든 포함된 이온 채널의 ectodomains은 목욕에 노출됩니다.

파트 6 : 예상 결과

일반적으로, 높은 저항 물개가 선호하고 더 이상 살고있다. 10 GΩ 품질이 우수한 밀봉을위한 좋은 지침이다. 우리의 경험에서이 품질의 바다표범을 얻는 확률은 품질 특히 셀 및 피펫 많은 요인과 다를 수 있습니다. 패치 수집 요금은 건강한 세포, 깨끗한 pipettes, 그리고 경험 연구원 95 % 이상 수 있습니다. 이러한 패치는 몇 분 동안 마지막으로 단일 채널 녹음을 포함한 Xenopus oocytes의 표현 이온 채널의 electrophysiological 연구에 적합합니다.

Discussion

여기에 논의하지 electrophysiological 녹음 많은 매개 변수가 있습니다. 릭 설치, 시스템 소음 관리, 채널 표현 및 기록 프로토콜은 모든 좋은 실험 결과 또한 중요합니다.

우리의 경험에서, 이들은 안정적인 물개를 형성을위한 가장 중요한 파라미터 : 목욕을 입력하면 고품질 oocytes는 (일명, "필링") 빠르게 vitelline 막 제거, 먼지로부터 보호 새로 가져온 pipettes 부드러운 pipettes, 적용 긍정적인 압력을 사용하여 솔루션 이전 실링에 욕조에 짧은 시간. 이되는 경험을 광범위하게 다양하고 다른 사람이 가장 중요한 요소 중 자신의 세트를 가지고있다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Patch Clamp Amplifier & Software	Instrument	HEKA Instruments	EPC-10	Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)	Tool	Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution	Reagent			Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
woven mesh	800 um	Spectrum Labs	146481