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Biology

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Published: October 16, 2008 doi: 10.3791/936

Summary

Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.

Abstract

Desde o seu desenvolvimento por Sakmann e Neher 1, 2, o patch clamp se estabeleceu como uma técnica extremamente úteis para a aferição eletrofisiológica de canais de iões simples ou múltiplas nas células. Esta técnica pode ser aplicada a canais iônicos tanto no ambiente de sua nativa e expresso em células heterólogas, como oócitos colhidos o sapo com garras Africano, Xenopus laevis. Aqui, descrevemos a técnica bem estabelecida de gravação de patch-clamp de oócitos Xenopus. Esta técnica é utilizada para medir as propriedades de canais iônicos, expressos quer em populações (macropatch) ou individualmente (single-channel de gravação). Nós nos concentramos em técnicas para maximizar a qualidade da preparação de oócitos e geração de selo. Com todos os fatores otimizados, esta técnica dá uma probabilidade de geração de selo de sucesso mais de 90 por cento. O processo pode ser otimizado de forma diferente por cada pesquisador com base nos fatores que ele ou ela acha mais importante, e nós apresentamos a abordagem que levaram à maior sucesso em nossas mãos.

Protocol

Parte 1: Remover a membrana vitelina

  1. Prepare dois conjuntos de fórceps. Nós preferimos No. 5 fórceps, onde um conjunto foi ligeiramente afiada com uma lima. Também preparar uma pipeta de vidro por corte e polimento-fogo de 7 "Pasteur pipeta.
  2. Recomendações: Para evitar que os oócitos de escorregar, corte um círculo de grade (1 praças mm) e cola na parte inferior de uma placa de Petri 60mm. Este prato pode ser reutilizado indefinidamente se mantidos limpos entre os usos.
  3. Encha o prato de Petri até a metade com solução hiperosmótico (ver receita) e colocar sob um microscópio de dissecação.
  4. Remover oócitos 03/01 Xenopus da sua solução de incubação com uma pipeta Pasteur polido e coloque no prato.
  5. Aguarde 15s - 2 min para que as células começam a encolher. Vezes mais fazer as células mais fáceis de descascar, tempos mais curtos para as células saudáveis ​​para remendar.
  6. Com a redução da célula, a membrana vitelina começará a tornar-se visível apenas como uma camada transparente sobre a célula. Selecione uma célula saudável (sem voltas ou defeitos) para peeling.
  7. Com um par de fórceps, gentilmente compreender a membrana vitelina sem danificar a membrana plasmática. Com a outra, segure perto do mesmo local e gentilmente rasgar a membrana transparente e livre para além da célula.
  8. Com a pipeta de Pasteur, cuidadosamente mover a célula para a câmara de gravação. Note-se que a célula será frágil após a remoção vitelínico.

Parte 2: geração Gigaseal

  1. Preencha uma pipeta de gravação com solução salina. Use o volume mínimo de solução que faz um bom contato elétrico com o fio de eletrodo de modo a minimizar a capacitância pipeta.
  2. Flick os tempos de pipeta para permitir que várias bolhas a flutuar e deslizar no fio do eletrodo.
    Aplicar pressão para a pipeta cheia. Isto pode ser feito por via oral ou com uma bomba de aquário de uma loja de animais. Esta pressão é fundamental para manter a pipeta limpa, uma vez que atravessa a interface líquido e se move para a célula.
  3. Encontrar o óvulo na câmara e focar fortemente na borda da célula.
  4. Com a pipeta de sair do banho, o centro da ponta (fora de foco) acima da célula. Desta vez, minimiza gasto no banho antes da geração do selo.
  5. Queda da pipeta para baixo em foco ao lado do celular. Trazê-lo em estreita proximidade (~ 50 microns). Você deverá ver uma pequena distorção de solução empurrado para fora da pipeta pela pressão de volta.
  6. Usando o software patch clamp, verifique a resistência da pipeta (nossa meta é de aproximadamente 3-4 mohms) e zerar o atual usando a tensão de offset.
  7. Com uma pressão positiva sobre a pipeta, mova a ponta lentamente em direção ao celular enquanto monitoramento da resistência visualmente ou utilizando um monitor de áudio que gera um tom cuja freqüência é proporcional à resistência. Como a ponta começa a tocar o celular, a resistência vai aumentar.
  8. De repente, mas com cuidado mudar de positivo para a pressão negativa de aproximadamente o mesmo valor absoluto. Resistência deve aumentar para selar formação.
  9. A maior parte do tempo, a formação de vedação ocorre dentro de alguns segundos, ocasionalmente 30-60 segundos são necessários.
  10. Uma vez que a resistência está em 1GΩ, a pressão pode ser liberado para neutro. Você agora tem um patch on-celular. Para um patch de dentro para fora, afastar a célula rapidamente. Para fora-out, veja abaixo.

Parte 5: Fora-out topologia (opcional)

  1. Imediatamente após atingir uma ruptura, gigaseal da membrana. Isto pode ser feito com sucção forte, mas nós preferimos a 1 V de pulso para 1 ms. A resistência deve cair para pouco mais do que a resistência inicial da pipeta.
  2. Mover a pipeta fora da célula lenta e suavemente. Você deverá ver uma parte da célula com o puxar da pipeta. De repente, e dentro de alguns segundos, o celular vai pular de volta ea resistência deve imediatamente e, simultaneamente, voltar ao GΩs.
  3. Você agora tem um patch na configuração fora-out. Ectodomínios de qualquer canais iônicos incluído é exposta ao banho.

Parte 6: Resultados Previstos

Geralmente, os focas maior resistência são preferíveis e mais vivido. 10 GÊ é uma boa orientação de alta qualidade selos. Em nossa experiência, as chances de selos desta qualidade variam de acordo com muitos fatores, especialmente celular e pipeta de qualidade. Taxas de aquisição patch pode ser mais de 95% com as células saudáveis, pipetas limpas, e um investigador experiente. Essas manchas podem durar muitos minutos e são adequados para qualquer estudo eletrofisiológico de canais iônicos expressos em oócitos Xenopus, incluindo um único canal de gravações.

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Discussion

Há muitos parâmetros de gravação eletrofisiológico não serão discutidos aqui. Configuração de equipamento, sistema de gestão de ruído, expressão de canais e protocolos de gravação são também essenciais para bons resultados experimentais.

Em nossa experiência, estes são os parâmetros mais críticos para a formação de selos de confiança: oócitos de alta qualidade, a remoção da membrana vitelina rapidamente (aka, "peeling"), use pipetas recém puxado protegido de poeira, pipetas suave, a pressão positiva aplicada ao entrar no banho solução, os tempos breve no banho antes de vedação. Dito isto, a experiência varia muito e outros têm seus próprios conjuntos de fatores mais importantes.

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Acknowledgments

Receita encolher solução é a partir do laboratório de RW Aldrich. Agradecemos aos seguintes agências de fomento e fundações de apoio: National Institutes of Health, National Science Foundation, a American Heart Association, Associação de Distrofia Muscular, o B. Donald e Delia E. Baxter Foundation, o Fundo Klingenstein e da Fundação McKnight for Neuroscience.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Patch Clamp Amplifier & Software Instrument HEKA Instruments EPC-10 Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs) Tool Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution Reagent Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
woven mesh 800 um Spectrum Labs 146481

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References

  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  2. Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).

Tags

Biologia Celular Edição 20 Eletrofisiologia Clamp Patch grampo de tensão Oócitos Biofísica Gigaseal canais iônicos
Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus
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Cite this Article

L Brown, A., E. Johnson, B., B.More

L Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936, doi:10.3791/936 (2008).

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