Het maken van Patch-pipetten en Sharp elektroden met een programmeerbare Puller

Summary

Deze video laat zien hoe u een programmeerbare trekker te gebruiken om patch pipetten en scherpe elektroden te maken voor elektrofysiologie. Dezelfde procedure kan gebruikt worden om een ​​verscheidenheid van glazen instrumenten, waaronder injectienaalden te maken.

Abstract

Glazen micro-elektroden (ook wel pipetten) zijn een werkpaard van elektrofysiologie voor decennia. Vandaag de dag worden dergelijke pipetten gemaakt van glas haarvaten met behulp van een programmeerbare trekker. Dergelijke instrumenten warmte van de capillaire met behulp van een metalen filament of een laser en trekken uit het glas met behulp van de zwaartekracht, een motor of beide. Pipetten voor patch-clamp opnamen worden gevormd met alleen warmte en zwaartekracht, terwijl de scherpe elektroden voor intracellulaire opname gebruik maken van een combinatie van warmte, de zwaartekracht, en een motor. De procedure gebruikt om de intracellulaire opname pipetten te maken is vergelijkbaar met die gebruikt voor de injectie naalden voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder cRNA injectie in Xenopus oöcyten te maken. In het algemeen, capillaire glas <1,2 mm in diameter wordt gebruikt om de pipetten voor patch clamp opname te maken, terwijl de smallere glas wordt gebruikt voor intracellulaire opname (buitendiameter = 1,0 mm). Voor elk gereedschap, is de trekker net iets anders geprogrammeerd. Deze video laat zien hoe je beide soorten van opname pipetten met behulp van vooraf vastgestelde puller programma's.

Protocol

Pulling pipetten

Met behulp van een micro-elektrode trekker, zoals de Sutter P-97 Flaming / Brown, trek een set van ongeveer 10-20 pipetten.

1. Selecteer uw capillaire glas. We maken gebruik van borosilicaat capillairen (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm buitendiameter, binnendiameter 1.1mm, 10cm lang). Zorgvuldig op te slaan, zodat het glas blijft schoon en stofvrij.
2. Ontwerp een programma te trekken. We maken gebruik van een 5 stappen programma, met dalende hitte en snelheid bij elke stap, en een kleine trek aan de laatste stap. Sutter's pipet kookboek is een uitstekende referentie voor het ontwikkelen van geschikte programma's.
3. Onderzoek de pipetpunten onder een microscoop om de opening met een diameter en gladheid te bepalen. Gooi ruw, oneffen of onregelmatig tips. Een goede trekken protocol moet ervoor zorgen dat deze zeldzaam zijn. Voor standaard patch-clamp-opname, moet tip openingen 1-3 micrometer in diameter. Een steile taper (stompe punt) leidt tot weerstand lager voor dezelfde opening diameter. Vorm en grootte kan gewijzigd worden door druk polijsten.

Brand polijsten pipetten

1. Stel een polijsten rig (microforge) met een platina filament verwarming gecontroleerd door een voetpedaal. Een handige kit is verkrijgbaar bij ALA Scientific (CPM-2) of een soortgelijk apparaat kan stukje bij beetje worden gemonteerd.
2. Optioneel: Smeer de pipet met een isolator aan capaciteit verminderen en verbeteren van geluid kenmerken. We maken gebruik van tandartsen. Sylgard 184 ™ (poly-dimethyl siloxaan elastomeer ook wel bekend als PDMS) is ook een optie.
3. Bij gebruik van wax, houd een kleine gesmolten aanbod in de buurt. Met de luchtdruk op de achterkant van de pipet om de was te houden van het invoeren van de pipet, dip de punt kort in op de vloeibare was en te verwijderen. Met Sylgard, op te slaan bereid elastomeer in bevroren aliquots en verf de pipetpunt onder een microscoop. Warmte aan het elastomeer genezen.
4. Plaats de pipet (gecoat of niet) in het polijsten apparaat en breng het uiteinde ~ 50 micron van de gloeidraad. Houd er rekening mee dat de gloeidraad zal uitbreiden bij verhitting.
5. Aanbevolen: Volg de apart protocol voor 'druk polijsten "om de vorm van de pipet voor een optimale weerstand en tip diameter te veranderen.
6. Een korte puls warmte (1-2 seconden) is voldoende om de was te verwijderen uit de punt van de pipet en het glas glad.
7. Plaats de pipet eindigde in een gesloten doos om te beschermen tegen stof, herhaal dit voor een succesvolle 10 pipetten.

Discussion

Het protocol geïllustreerde is hier in het dagelijks gebruik in de elektrofysiologie laboratoria en wordt ook gebruikt om injectienaalden te maken voor cellen en dieren. Met een programmeerbare trekker, is het gemakkelijk om pipetten te maken voor een scala van toepassingen. Met aandacht en zorg, zal de gloeidraad op uw trekker voor een jaar of meer. Veel succes met je experimenten.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.