Summary
이 동영상은 전기 생리학에 대한 패치 pipettes과 날카로운 전극을 만들 수있는 프로그램 풀러를 사용하는 방법을 보여줍니다. 동일한 절차는 주사 바늘을 포함한 유리 다양한 도구를 만드는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
유리 microelectrodes는 (또한 pipettes라고도 함) 수십 년 동안 전기 생리학의 일하는 말이되어 왔습니다. 오늘날과 같은 pipettes은 프로그램 풀러를 사용하여 유리 모세관에서 만들어집니다. 이러한 악기 열 금속 필라멘트 또는 레이저와 중력, 모터 또는 둘 모두를 사용하여 유리를 그릴 중 하나를 사용하여 모세관. 세포내 레코딩을위한 날카로운 전극은 열, 중력, 그리고 모터의 조합을 사용하는 동안 패치 - 클램프 녹음 Pipettes은 단 열과 중력을 이용하여 형성됩니다. 세포내 기록 pipettes를 만들기 위해 사용되는 절차는 Xenopus의 oocytes에 cRNA 분사를 포함한 다양한 어플 리케이션을위한 주사 바늘을 만들기 위해 사용하는 것과 비슷합니다. 좁은 유리 세포 기록 (외경 = 1.0 ㎜)에 사용되는 동안 일반적으로, 모세관 유리에 직경 <1.2 mm은 패치 클램프 녹음 pipettes을하는 데 사용됩니다. 각 도구에 대한, 풀러가 약간 다르게 프로그램입니다. 이 비디오는 사전에 설립 풀러 프로그램을 사용 기록 pipettes 두 가지를하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
풀링 pipettes
풀러 등 서터 P - 97 플라밍 / 브라운으로 microelectrode를 사용하여 약 10-20 pipettes 세트를 가져옵니다.
- 당신의 모세관 유리를 선택합니다. 우리는 borosilicate 모세관 (서터 BF150 - 110 - 10, 1.5mm 외경, 내경 1.1mm, 길이 10cm)을 사용합니다. 그것이 깨끗하고 먼지가 무료로 남아 있도록 신중하게 유리를 저장합니다.
- 당기는 프로그램을 디자인합니다. 우리는 내림차순 열과 속도의 각 단계에서, 그리고 마지막 단계에있는 작은 당겨와 5 단계 프로그램을 사용합니다. 서터의 피펫 요리책은 적합한 프로그램을 개발하기위한 훌륭한 레퍼런스입니다.
- 개방 직경과 매끄러운를 결정하는 현미경 피펫 팁을 검사합니다. 거친 고르지 또는 불규칙 조언을 폐기하십시오. 좋은 당기는 프로토콜이가 드문 있도록해야합니다. 표준 패치 - 클램프 녹음, 팁 구멍은 직경 1-3 미크론해야합니다. 가파른 테이퍼 (뭉툭한 끝)은 같은 오프닝 직경에 대한 저항을 낮은 발생합니다. 모양과 크기가 압력 연마에 의해 수정할 수 있습니다.
소방 연마 pipettes
- 발 페달에 의해 통제 플래티넘 가열 필라멘트와 연마 장비 (microforge)를 설정합니다. 유용한 키트 에이러 과학 (CPM - 2) 또는 이와 유사한기구가 조금씩 조립하실 수 있습니다.
- 옵션 : 코트 용량을 감소 및 소음 특성을 개선하기 위해 절연체로 피펫. 우리는 치과 왁스를 사용합니다. Sylgard 184 ™은 (또한 PDMS로 알려진 폴리 디메틸 실록산 - 엘라스토머)도 옵션입니다.
- 왁스를 사용하는 경우, 작은 용융 공급이 근처에 보관. 피펫을 입력에서 왁스를 유지하기 위해 피펫의 뒷면에 공기 압력으로 액체 왁스에 팁 잠시을 찍어 제거합니다. Sylgard으로 저장, 준비 냉동 aliquots의 탄성과 현미경 피펫 팁을 페인트. 탄성체를 치료하기 위해 열.
- 연마 장치에 피펫을 (코팅 여부) 장소 및 팁에게 필라멘트에서 ~ 50 미크론 가져. 가열하면 필라멘트가 확장됩니다 유의하십시오.
- 추천 : 최적의 저항과 팁 직경에 대한 피펫의 모양을 변경하려면 "압력 연마"에 대한 별도의 프로토콜을 수행합니다.
- 간단한 열 펄스 (1~2초)는 피펫의 팁을에서 왁스를 제거하고 유리를 부드럽게하기 위해 충분하다.
- , 먼지로부터 보호하기 10 성공 pipettes을 반복하는 닫힌 상자에 완성된 피펫를 놓습니다.
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Discussion
프로토콜 그림 여기에 전기 생리학 실험실에서 일상 사용되고 또한 세포 및 동물 주입 바늘을하는 데 사용됩니다. 프로그램 풀러와 함께, 그것은 사용의 다양한 pipettes를 만들기 위해 쉽습니다. 관심과 관리를 통해 귀하의 풀러의 필라멘트는 1 년 이상 지속됩니다. 실험과 함께 행운을 빕니다.
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Acknowledgments
보건 국립 연구소, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 미국 심장 협회, 근육질 영양 장애 협회, 도널드 B.와 델리아 E. 백스터 재단 Klingenstein 기금과 신경 과학에 대한 맥나이트 엔다우먼트 : 우리는 지원을위한 다음과 같은 자금 지원 기관 및 재단 감사드립니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette Puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | P-97 | Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000) |
| Glass Capillaries | Reagent | Sutter Instrument Co. | BF150-86-10 | Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament. |
References
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
