Создание Patch-пипетки и Sharp Электроды с программируемой Puller

Summary

Это видео показывает, как использовать программируемые съемник, чтобы сделать патч пипетки и острые электроды для электрофизиологии. Аналогичная процедура может быть использована для разнообразных стеклянных инструментов, в том числе введение иглы.

Abstract

Стекло микроэлектродов (также называется пипетки) были лошадкой электрофизиологии на протяжении десятилетий. Сегодня такие пипетки изготавливаются из стеклянных капилляров использованием программируемых съемника. Такое тепло инструментов капиллярной используя либо нити металла или лазера и извлечь из стекла, используя гравитацию, двигателя или обоих. Пипетки для патч-зажим записи формируются с использованием только тепло и гравитация, в то время как резкое электродов для внутриклеточной регистрации использовать сочетание тепла, тяжести, и двигатель. Процедура используется для внутриклеточных пипетки записи аналогична используется, чтобы сделать инъекции иглами для различных приложений, в том числе кРНК инъекции в ооциты Xenopus. В общем, капиллярные стеклянные <1,2 мм в диаметре используется для изготовления пипеток для исправления записи зажим, в то время как узкие стекло используется для внутриклеточной регистрации (наружный диаметр = 1,0 мм). Для каждого инструмента, съемник запрограммировано несколько иначе. Это видео показывает, как сделать оба вида записи пипетки с использованием предварительно установленными программами съемника.

Protocol

Тяговая пипетки

Использование микроэлектрода съемник, таких как Саттер Р-97 Flaming / Браун, тянуть набор примерно 10-20 пипеток.

1. Выберите капиллярной стекла. Мы используем боросиликатного капилляров (Саттер BF150-110-10, внешний диаметр 1,5 мм, 1,1 мм внутренний диаметр, 10 см в длину). Магазин стекла осторожно, чтобы она остается чистой и без пыли.
2. Дизайн потянув программы. Мы используем 5-ти ступенчатая программа, с нисходящим тепла и скорость на каждом этапе, и небольшой тянуть на последний шаг. Пипетки поваренную книгу Саттера является отличным основу для разработки соответствующих программ.
3. Проверьте наконечники под микроскопом, чтобы определить диаметр открытия и гладкость. Отменить грубая, неровная, или нерегулярные советы. Хороший потянув протокол должен обеспечить эти редки. Для стандартных патч-зажим записи, наконечник отверстия должны быть 1-3 мкм в диаметре. Крутым конусом (тупым кончиком) приводит к снижению сопротивления для того же диаметра отверстия. Форма и размеры могут быть изменены под давлением полировки.

Пипетки пожарной полировки

1. Настройка полировки машина (microforge) с платиновая нить отопления управляется ножной педалью. Полезный комплект можно получить в Научно ALA (CPM-2) или аналогичные устройства могут быть собраны по частям.
2. Дополнительно: Пальто пипетки с изолятором для уменьшения емкости и улучшения шумовых характеристик. Мы используем зубных слепков. Sylgard 184 ™ (поли-диметил силоксановых эластомеров также известный как PDMS) тоже вариант.
3. При использовании воска, сохранить небольшой расплавленный питания поблизости. При давлении воздуха на задней пипетки сохранить воск от входа в пипетку, окуните кончик кратко в жидкий воск и удалить. С Sylgard, хранения подготовленных эластомера в замороженных аликвоты и краски пипетки под микроскопом. Тепло вылечить эластомера.
4. Место пипетки (с покрытием или нет) в полировке аппарата и довести кончике ~ 50 микрон от нити. Имейте в виду, что нить будет расширяться при нагревании.
5. Рекомендуем: Следуйте отдельный протокол для "давления полировки", чтобы изменить форму пипетки для оптимального сопротивления и диаметр кончика.
6. Короткого импульса тепла (1-2 секунды) является достаточным для удаления воска от кончика пипетки и гладким стеклом.
7. Место готовой пипетки в фургон для защиты от пыли, повторите для 10 успешных пипеток.

Discussion

Протокол показано здесь в ежедневном использовании в электрофизиологии лабораторий, а также используется, чтобы сделать инъекции иглами для клеток и животных. С программируемой съемник, это легко сделать пипетки для различных целей. С вниманием и заботой, нити на съемник будет длиться в течение одного года или более. Удачи вам в ваших экспериментах.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.