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Biology

Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

Published: November 26, 2008 doi: 10.3791/945

Summary

Um método simples e específica foi demonstrada para marcação fluorescente e detecção aprimorada de proteínas de superfície das células sem uma etapa de fracionamento. Abundância diferencial de proteínas de superfície celular foi analisada através de eletroforese bidimensional (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.

Abstract

Proteínas de superfície são fundamentais para a capacidade da célula para reagir ao seu ambiente e interagir com as células vizinhas. Eles são conhecidos por serem indutores de quase todos os de sinalização intracelular. Além disso, eles desempenham um papel importante na adaptação ambiental e tratamento de drogas, e muitas vezes são envolvidos na patogênese da doença e patologia (1). Interações proteína-proteína são intrínsecos a vias de sinalização, e para ter mais conhecimento nesses processos biológicos complexos, métodos sensíveis e confiáveis ​​são necessárias para estudar as proteínas de superfície celular. Eletroforese bidimensional (2-D) é amplamente utilizado para detecção de biomarcadores e outros alvos em amostras de proteínas complexas para estudar mudanças diferencial. Proteínas da superfície celular, em parte devido à sua baixa abundância (1 2% de proteínas celulares), são difíceis de detectar, em um gel 2-D sem fracionamento ou algum outro tipo de enriquecimento. Eles também são muitas vezes mal representado em 2-D gels devido à sua natureza hidrofóbica e alto peso molecular (2). Neste estudo, apresentamos um novo protocolo para células intactas usando corantes CyDye DIGE Fluor mínima para a rotulagem específica e detecção deste importante grupo de proteínas. Os resultados mostraram rotulagem específica de um grande número de proteínas de superfície celular com rotulagem mínima de proteínas intracelulares. Este protocolo é rápido, simples de usar, e os três corantes CyDye DIGE Fluor mínima (Cy 2, 3 e Cy Cy 5) pode ser usado para rotular as proteínas da superfície celular. Esses recursos permitem a multiplexação usando o 2-D Eletroforese Gel Fluorescence Difference (2-D DIGE) com tecnologia Ettan DIGE e análise das mudanças da proteína expressão usando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial. O nível de proteínas da superfície celular foi seguido durante a inanição de soro de células CHO para vários comprimentos de tempo (ver Tabela 1). Pequenas mudanças em abundância foram detectados com alta precisão, e os resultados são apoiados por métodos estatísticos definidos.

Protocol

Cultura de células

  1. Cultivar células de ovário de hamster chinês (CHO-K1), utilizando os procedimentos padrão de cultura de células em F-12 com meio Ham Glutamax I contendo 10% de soro fetal bovino, 50 U / ml de penicilina, e 50 mcg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen).
  2. Trocar o meio de cultura sem soro para meios de comunicação. Proteínas rótulo superfície da célula foram em momentos diferentes com CyDye DIGE Fluor Cy3 ou Cy5 corantes mínimo (ver secção Labeling superfície celular, abaixo).
  3. Piscina números iguais de células de cada momento e etiqueta com CyDye DIGE Fluor Cy2. Usá-los como um padrão interno para cada gel 2-D.
  4. A maioria dos experimentos podem ser realizados com células CHO-K1, mas fibroblastos de rato embrião (L1 3T3) e linfoblastos rato ascite linfoma (EL4) também pode ser usada (dados não mostrados).
  5. Crescer os dois últimos tipos de células em DMEM com Glutamax II, mas, caso contrário, use condições idênticas usada para as células CHO-K1.

Rotulagem superfície celular

  1. Cuidadosamente separar células aderentes não enzimaticamente, contando e dividindo-se alíquotas de 5-10 células x106. Para células cultivadas em suspensão, omita o passo destacando.
  2. Centrifugar a suspensões de células em cerca de 800 xg por 5 minutos. Remover o sobrenadante contendo o meio.
  3. Lavar as pelotas por resuspendion em solução 1 ml de gelo frio Hank salina balanceada (HBSS) pH 8.5. Centrifugado a 800 xg, a 4 ° C por 2 minutos.
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 200 mL de buffer rotulagem gelada (HBSS pH 8.5, 1 M uréia).
  5. Rótulo as células intactas com 600 pmol CyDye corantes DIGE Fluor mínimo por 20 minutos no gelo no escuro.
  6. Saciar a reação pela adição de 20 l 10 mM de lisina. Incubar por 10 minutos.
  7. Lavar a superfície marcada com células duas vezes por ressuspensão em 500 mL pH HBSS 7,4, seguido por centrifugação a 800 xg, a 4 ° C por 2 minutos.

Lise celular e fracionamento

  1. Lisar a superfície marcada com células em 150 mL tampão de lise fria (7 uréia M, 2 M tiouréia, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 5 mM de acetato de magnésio 8,5). Deixe na geladeira por pelo menos 1 h com vórtex ocasionais.
  2. Centrifugar a lisados ​​em 10 000 xg, a 4 ° C por 5 minutos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Esta amostra é a amostra não fracionada contendo todas as proteínas celulares.
  3. Em paralelo, lave pellets de células, como acima, então fracionar (usando um kit de fracionamento de membrana, Pierce) em membrana e frações citosólica antes de 2-D eletroforese em gel. A fração de membrana contém proteínas da membrana interna e da superfície celular.
  4. Para efeito de comparação, seguem o padrão Ettan procedimento DIGE 3, e lise, rótulo, e, finalmente, fracionar as células. Determinar a concentração de proteína nas amostras utilizando a 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

2-D electrophoresis

  1. Reidratar géis DryStrip Immobiline, pH 3-11NL (24 cm) usando bandeja DryStrip Immobiline Reswelling, 24 cm em 450 mL de solução DeStreak Reidratação (0,5% IPG Buffer) durante a noite.
  2. Aplicar o CyDye marcado amostras (correspondente a 50 mg de proteína total) para Immobiline DryStrip carregando géis copo anódica no coletor e realizar focalização isoelétrica (IEF), utilizando Ettan IPGphor II Sistema IEF acordo com as instruções.
  3. Depois IEF, equilibrar as tiras em duas etapas e coloque em cima de grandes dimensões (26 x 20 cm) géis de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE). Sobreposição com agarose 0,5% (em tampão de corrida contendo azul de bromofenol). Executar 2-D electrophoresis usando Ettan DALTtwelve Sistema Vertical Grande a 5 W / gel por 30 min, e depois de 15 W / gel até que a frente de corante atinge o fundo do gel.

De imagem e análise de dados

  1. Depois de completar 2-D electrophoresis, digitalizar os géis para Cy2, Cy3 ou Cy5 usando um Typhoon 9410 Imager modo variável.
  2. Compare os mapas no local a partir de frações de membrana, frações citosólica e não-fracionada amostras usando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial 4.

Pós-coloração

  1. Depois de imagem, prata manchar o gel de acordo com procedimento padrão 5.

Identificação de proteínas

  1. Crescer, colheita, lavagem e lisar quantidades preparativa (aproximadamente 1 mg de proteína total de 10 x106 células CHO) de células, como descrito acima para uma amostra não-fracionada. Use uma amostra Cy5 superfície da célula marcada (veja acima) como um pico, e aplicado em conjunto com os montantes unlabelled preparativa de proteínas.
  2. Realização de eletroforese 2-D, como descrito acima, mas desta vez, aplly 600 mg de células unlabeled lisado em conjunto com 50 mg de superfície celular rotulados pico anódica por aplicação copo. Use os marcadores de referência para permitir escolher ponto correto, e coloque aentre as placas de vidro antes de lançar gel acordo com as recomendações 3.
  3. Digitalizar o gel em Cy5 canal para obter as células Cy5 mapa de locais de superfície, seguido por coloração de proteínas totais utilizando proteína total Deep Purple mancha 3.
  4. Partida em conjunto os dois mapas no local usando o DeCyder 2-D de software e criar uma lista de seleção para todos os pontos correspondentes às cinco Cy proteínas de superfície celular rotulados. Escolha proteínas da superfície celular usando a estação de tratamento de Ettan spot, extrair as fichas gel, e usando o digestor trypsinate Ettan. Identificar utilizando MALDI-TOF espectrometria de massa.

Tabela 1. Ettan Um experimento DIGE foi realizada utilizando amostras de soro de células esgotados rotuladas de acordo com o protocolo de rotulagem da superfície celular da proteína na figura 1.

Amostra Tempo de esgotamento do soro Rotulados com CyDye Número de gel
1 - Cy 3, 2 Cy 1
2 30 minutos Cy 5, 2 Cy 1
3 2 horas Cy 3, 2 Cy 2
4 4 horas Cy 5, 2 Cy 2
5 16 horas Cy 5, 2 Cy 3

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Discussion

Concentração de proteína

Uma visão geral dos dois fluxos de trabalho rotulagem é mostrado na Figura 1. Uma vez que as células ainda estão intactas quando rotuladas de acordo com o protocolo de rotulagem de proteína da superfície celular, apenas as proteínas de superfície das células são expostas ao corante. No padrão Ettan DIGE protocolo, as células são lisadas antes de rotulagem e proteínas tanto dentro como fora da célula são rotulados (Fig. 1). A quantidade relativa de corante à proteína no protocolo de rotulagem da superfície celular da proteína não é conhecida, já que as proteínas da superfície celular não pode ser especificamente quantificado. No entanto, sabe-se que as proteínas de superfície celular constituem uma proporção muito baixa das proteínas celulares 2. Aproximadamente 5-10 x10 6 células de 600 pmol de tinta foram usados. Pode ser possível usar células menos uma vez que apenas 12,5-25% da amostra nonfractionated neste estudo foi utilizada para eletroforese 2-D.

Figura 1

Fig. 1. Visão geral de rotulagem protocolos de fluxo de trabalho

Concentrações de proteína nas diferentes frações foram determinados usando o 2-D Kit Quant. A quantidade total de proteínas derivadas de 10 x10 6 células CHO-K1 foi 920 mg na amostra não fracionada, 225 mg na membrana mg / fração hidrofóbica e 770 na fração citosólica / hidrofílica. Estes montantes serão provavelmente variam dependendo do tipo de célula e tamanho da célula. A proporção de proteínas que são rotulados no protocolo da superfície celular pode ser maior do que o padrão rotulagem DIGE Ettan mínimo, que é de 2-3% de proteína total. Parece que só uma molécula do corante é anexado por molécula de proteína, uma vez que a forma local é listras verticais redondas e das proteínas de baixo peso molecular no gel está ausente (Fig. 2 e 3). Duas ou mais moléculas de corante por proteínas causaria listras verticais, devido ao aumento do peso molecular da proteína marcada. Este fenômeno, geralmente, ser visto com a proteínas de baixo peso molecular, uma vez que uma mudança no peso molecular dessas proteínas poderia resultar em uma mudança maior no gel em comparação com proteínas de alto peso molecular.

Proteína da superfície celular específicos de rotulagem

Duas amostras idênticas de células foram marcadas com superfície CyDye DIGE Fluor Cy3. Um deles foi lisados ​​e usado diretamente para 2-D electrophoresis. A outra amostra foi lisados ​​e fracionado em membrana e frações citosólica. Toda a etiqueta fluorescente apareceu na fração de membrana, a fração citosólica era desprovida de qualquer proteína marcada (Fig. 2). Mesmo gel com a amostra de proteína citosólica estava manchada de prata eo resultado mostrou que houve proteínas no gel, mas não eram rotulados com a superfície celular protocolo de rotulagem de proteína. Estes resultados sugerem que este protocolo nova rotulagem é específica para as proteínas de superfície celular. O CyDye DIGE corante Fluor mínima não parece entrar na célula ou passar através da membrana celular. As células são mantidas em gelo antes da rotulagem e isso pode reduzir qualquer transporte através da membrana. O tempo de exposição ao corante CyDye DIGE Fluor mínima também é relativamente curto (20 minutos), que é suficiente para a rotulagem de proteína, mas não para a entrada na célula. Outra possível explicação para a falta de rotulagem dentro da célula é que mesmo que o corante passa através da membrana, o pH dentro da célula é muito baixo (<pH 7,4) por uma reacção de marcação eficiente para ocorrer (pH ótimo 8,5). A reacção de marcação se apaga seguido de lavagem das células, o que mais impede qualquer rotulagem de proteína após as células foram lisadas. Este método tem sido aplicado com sucesso em linhas de células humanas in vitro, bem como a um complexo sistema biológico in vivo 7.

Figura 2

Fig. 2. Especificidade da superfície celular rotulagem proteína.

As proteínas cellsurface de células CHO-K1 foram marcados com Cy3 e fracionado. As diferentes frações foram separados por eletroforese 2-D e digitalizados para Cy3 fluorescência (A). Os géis foram corados mesma prata (B).

Fracionamento

Existem apenas pequenas diferenças no padrão de ponto para a amostra de membrana-fracionada em comparação com a amostra nonfractionated (Fig. 2). Os dois mapas foram comparados local usando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial e todos os pontos detectados na fração de membrana também estavam presentes na amostra não fracionada. Fracionamento, portanto, não é necessário para melhorar a detecção de proteínas de superfície celular, mas pode ser usado para verificar a falta de rotulagem de proteínas dentro das células.

Comparação entre protocolos

Para ser capaz de avaliar as vantagens com o novo profissional da superfície celulartein rotulagem de protocolo, uma comparação com o padrão Ettan DIGE protocolo foi realizado. Duas amostras idênticas de células CHO-K1 crescido no mesmo frasco foram rotulados em paralelo com os dois protocolos diferentes, respectivamente (Fig. 1). A superfície celular Cy5 amostra rotulada foi executado no mesmo gel como um lisado celular Cy3 rotulados. Os pontos verdes (Cy3) no gel (Fig. 3A) representam as proteínas rotulados com o procedimento padrão DIGE Ettan seguido de fraccionamento da membrana. Estes pontos são, presumivelmente, as proteínas da membrana, incluindo as proteínas da superfície celular, bem como proteínas de membranas no interior da célula (ER, Golgi, mitocôndria e núcleo). Padrão Ettan procedimento rotulagem DIGE seguido por uma etapa de fracionamento de membrana foi escolhida para comparação, uma vez que deve dar a maior probabilidade de detecção do baixo proteínas de superfície de células abundantes. As manchas vermelhas (Cy 5) no gel (Fig. 3A) são proteínas específicas da superfície celular rotulados usando o novo protocolo de rotulagem da superfície celular da proteína que não são visíveis com o procedimento padrão de rotulagem (manchas verde). Além disso, as manchas amarelas representam proteínas sobrepostas que ocorrem em ambas as amostras usando o procedimento (Fig. 3A). Outra aplicação útil seria combinar os dois protocolos rotulagem para distinguir as proteínas na superfície da célula daqueles em membranas intracelulares. Além disso, informações sobre mudanças relativas nos níveis de superfície celular / membrana proteína após vários estímulos poderia ser seguido por ambas as técnicas rotulagem simultaneamente.

Figura 3.2Figura 3.1

Fig. 3.

(A) 2-D imagens de um gel CHO-K1 Cy5 amostra da superfície celular rotulada (manchas vermelhas, ver o protocolo 1, Fig. 1) e uma membrana Cy3 amostra fracionada (manchas verde, ver o protocolo 2, Fig. 1) rotulados de acordo com padrão Ettan DIGE protocolo executado no gel 2-D mesmo. (B) DeCyder 2-D Diferencial visualizações Análise Software do gel 2-D mostrando uma proteína da superfície celular rotulados não visíveis usando o padrão Ettan DIGE protocolo.

Identificação de proteínas de superfície celular

Como o padrão local é muito diferente entre uma superfície de células rotuladas amostra e uma amostra de proteína total rotulados, foi necessário incluir uma superfície celular rotulados pico para habilitar correspondência e identificação dos pontos da superfície celular no mapa de locais preparativa. Todas as proteínas de superfície celular foram escolhidos. Proteínas de superfície celular pode ser difícil de identificar devido à sua baixa abundância. A quantidade de proteína real em alguns pontos pode ser insuficiente para a identificação, já que as proteínas de superfície celular são visualmente enriquecido e não enriquecido fisicamente usando esse protocolo. Para facilitar a identificação bem-sucedida de proteínas de baixo da superfície abundante de células, os montantes preparativa de proteína total pode ser enriquecido para proteínas da membrana antes da aplicação em 2-D electrophoresis. Nessas células CHO, proteínas da membrana intracelular e proteínas de superfície das células constituem aproximadamente 20% do total de proteínas nas células. Para este tipo de célula, a quantidade de proteína nos pontos poderia ser aumentada por um fator 5 por enriquecimento de proteínas da membrana. Além disso, o uso de intervalos estreitos de gradiente de pH das tiras IPG vai permitir a aplicação de maiores quantidades de proteína. Neste estudo foram utilizadas apenas 600 mg de proteína total, sem enriquecimento de proteínas da membrana, e uma tira de IPG ampla gama. Nós ainda eram capazes de identificar um grande número de proteínas de superfície das células, dos quais 82% eram previamente conhecidas como proteínas de membrana associadas.

Multiplexação

Para testar a superfície celular protocolo de rotulagem de proteína em um experimento DIGE Ettan usando todos os três corantes 6, uma série de amostras de soro a partir de células CHO esgotados foram coletadas e proteínas de superfície celular rotulados em momentos diferentes (Tabela 1). As amostras foram separadas por eletroforese 2-D. A preparação de um padrão interno para uma experiência DIGE da superfície celular é simples. Neste caso, Cy 2 amostras da superfície celular rotulados (de todos os pontos do tempo) foram agrupados e usado como um padrão interno aplicado a cada gel 2-D. Superfície celular todos os três CyDye corantes DIGE Fluor mínima proteínas rotuladas de forma semelhante (dados não mostrados). Mudanças na expressão durante a inanição soro para muitas das proteínas de superfície das células foram detectadas utilizando DeCyder 2-D de software (Fig. 4).

Figura 4

Fig. 4.

Mudança na expressão de duas proteínas da superfície celular durante a fome de células CHO-K1. Mapas no local foram analisados ​​usando DeCyder 2-D de software de análise diferencial.

Conclusões

O novo protocolo Ettan DIGE para a célula rotulagem proteína de superfície é rápido, simples de usi e altamente específico para rotulagem proteínas de superfície celular. Muitos romance proteínas de superfície celular são apenas detectável quando se utiliza a superfície celular protocolo de rotulagem de proteína. Mais de 80 novas proteínas de superfície celular de células CHO foram detectadas utilizando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial. Mais de 80% dos pontos identificados superfície de células marcadas foram as proteínas da membrana associadas.

Multiplexação é conseguido usando os três CyDye corantes DIGE Fluor mínima, e em combinação com DeCyder 2-D de software, este novo protocolo é uma ferramenta poderosa para estudar as proteínas de superfície celular com todas as vantagens obtidas com a tecnologia DIGE 2-D.

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Acknowledgments

Agradecemos a Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer e Sigurd Krieger no Instituto de Patologia Clínica, Universidade de Viena, na Áustria, por sua colaboração.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol Reagent GE Healthcare 28-9345-30
2-D Quant Kit Reagent GE Healthcare 80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL Reagent GE Healthcare 17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm Reagent GE Healthcare 17-6003-77
IPGbox Tool GE Healthcare 28-9334-65
IPGbox kit Tool GE Healthcare 28-9334-92
DeStreak Rehydration solution Reagent GE Healthcare 17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid Reagent GE Healthcare 17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit Instrument GE Healthcare 11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold Instrument component GE Healthcare 80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster Tool GE Healthcare 80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit Instrument GE Healthcare 80-6466-46 230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager Instrument GE Healthcare 63-0055-81
Ettan Spot Picker Instrument GE Healthcare 18-1145-28
Ettan Digester Instrument GE Healthcare 18-1142-68
Ettan Spotter Instrument GE Healthcare 18-1142-67
Ettan MALDI-TOF Instrument GE Healthcare 18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software Other GE Healthcare 28-4012-01
ImageQuant Analysis Software Other GE Healthcare 28-9236-62
Urea Reagent GE Healthcare 17-1319-01
CHAPS Reagent GE Healthcare 17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT) Reagent GE Healthcare 17-1318-01
Bromophenol Blue Reagent GE Healthcare 17-1329-01
Tris Reagent GE Healthcare 17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS) Reagent GE Healthcare 17-1313-01
PlusOne Glycerol 87% Reagent GE Healthcare 17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C Reagent GE Healthcare 17-1310-01
PlusOne TEMED Reagent GE Healthcare 17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate Reagent GE Healthcare 17-1311-01
PlusOne Glycine Reagent GE Healthcare 17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins Reagent Pierce, Thermo Scientific 89864
Streptomycin sulphate Reagent Invitrogen 15140-122

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References

  1. Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
  2. Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
  3. Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
  4. DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
  5. 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
  6. CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
  7. Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
  8. Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).

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Cite this Article

Hagner-McWhirter, A., Winkvist, M.,More

Hagner-McWhirter, A., Winkvist, M., Bourin, S., Marouga, R. Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes. J. Vis. Exp. (21), e945, doi:10.3791/945 (2008).

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