Summary
一个简单的和具体的方法是没有分馏步骤细胞表面蛋白的荧光标记和增强检测证明。差分在细胞表面的蛋白质丰度使用的二维（2 - D）电泳和Ettan™DIGE技术进行了分析。
Abstract
表面蛋白是细胞的反应能力，它的环境，与邻近的细胞相互作用的核心。它们是已知的几乎所有的细胞内信号诱导。此外，他们在环境适应和药物治疗发挥重要作用，而且往往在疾病的发病机制和病理（1）参与。蛋白质 - 蛋白质相互作用的内在信号通路，并获得更深入地了解这些复杂的生物过程，需要敏感和可靠的方法是研究细胞表面的蛋白质。二维电泳（2 - D）是广泛用于复杂的蛋白质样品中的生物标志物和其他目标的检测，研究差的变化。细胞表面蛋白，部分原因是由于他们的低丰度（1 2％的细胞蛋白），是很难检测到，没有分馏或一些其他类型的浓缩在一个2 - D凝胶。他们也往往不佳的2 - D凝胶，由于其疏水性和超高分子量（2）表示。在这项研究中，我们提出一个新的协议为使用这种蛋白质的重要的一组特定的标签和检测CyDye DIGE Fluor公司最小的染料的完整细胞。结果表明：大量的细胞表面蛋白与细胞内蛋白质的最小标签的具体标注。此协议是快速，简单易用，所有三个CyDye DIGE Fluor公司（赛扬2，赛扬3和CY 5）最小的染料，可用于标记细胞表面蛋白。这些特性允许复用的2 - D荧光差异凝胶电泳（2 - D DIGE）Ettan DIGE技术和使用DeCyder的2 - D差异分析软件蛋白表达变化的分析。随后在CHO细胞中不同的时间长度（见表1）血清饥饿的细胞表面蛋白的水平。丰富的小变化，具有精度高，检测结果是由定义的统计方法的支持。
Protocol
细胞培养
- 种植中国仓鼠卵巢细胞（CHO - K1）使用标准细胞培养过程中的F - 12火腿中含10％小牛血清，50 U / ml青霉素，50μg/ ml的硫酸链霉素（Invitrogen公司）与GlutaMAX我。
- 交易所培养基，无血清培养基。标签的细胞表面蛋白CyDye DIGE Fluor公司Cy3标记或Cy5最小的染料（见部分细胞表面标记 ，下面）在不同的时间点。
- 从各时间点和CyDye DIGE Fluor公司CY2标签细胞的数目相等的池。使用这些内部标准为每一个2 - D凝胶。
- CHO - K1细胞进行的实验都可以，但小鼠胚胎成纤维细胞（3T3 L1）和小鼠腹水淋巴瘤淋巴母细胞（EL4）也可以使用（数据未显示）。
- 成长与GlutaMAX第二DMEM培养基中的两个后一种类型的细胞，但是，否则，使用相同的条件下使用的CHO - K1细胞。
细胞表面的标签
- 仔细非酶解，分离贴壁细胞计数和到5-10 x106细胞等份划分。对于悬浮液中生长的细胞，省略了分离步骤。
- 离心5分钟，约800 XG的细胞悬液。含介质取出上清液。
- 1毫升冰冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）pH值8.5 resuspendion洗净颗粒。离心800 XG在4 ° C时2分钟。
- 去除上清，悬浮细胞沉淀（pH值8.5的HBSS，1 M尿素）200μL冰冷的标签缓冲区。
- 标签完整的细胞，与600 pmol CyDye DIGE Fluor公司最少为20分钟，在黑暗中冰染料。
- 淬火加入20μL10毫米赖氨酸的反应。孵育10分钟。
- 两次在500μL的HBSS pH值7.4，在4 ° C时2分钟离心800 XG洗净再悬浮的表面标记的细胞。
细胞裂解和分馏
- 在150μL冷裂解液（7 M尿素，硫脲2米，4％CHAPS，30毫米三，5毫米醋酸镁的pH值8.5）的表面标记的细胞裂解。冰离开至少1 h偶有震荡。
- 离心机在10 000 XG的细胞裂解液在4 ° C 5分钟。将上清转移至新管。此示例的非分割的样本包含了所有的细胞蛋白。
- 与此同时，洗细胞沉淀，如上，然后分馏（使用的膜分离组件，皮尔斯）到细胞膜和细胞质组分之前的2 - D凝胶电泳。膜分数包含内部和细胞表面的膜蛋白。
- 相比较而言，遵循的标准Ettan DIGE过程3，和裂解，标签，和，最后，分馏的细胞。确定在使用2个样品的蛋白质浓度 - D定量试剂盒（GE医疗）。
2 - D电泳
- 补充水分Immobiline DryStrip凝胶，pH值3 - 11NL（24厘米）使用Immobiline DryStrip Reswelling纸盒，24厘米在450μLDeStreak补液盐（0.5％IPG缓冲）过夜。
- 应用CyDye标记的样本（相当于50μg总蛋白）Immobiline在多方面的阳极杯加载DryStrip凝胶和执行等电聚焦（IEF），根据指示使用Ettan IPGphor II等电聚焦系统。
- 国际盛事基金，平衡后的带两个步骤和大（26 × 20厘米）12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）上进行。运行缓冲液含有溴酚蓝）与0.5％的琼脂糖覆盖（。运行2 - D电泳使用Ettan DALTtwelve大型垂直系统在5 / 30分钟凝胶，然后在15瓦/凝胶，直到染料前沿到达凝胶底部。
成像和数据分析
- 完成2 - D电泳后，凝胶，使用一个台风9410可变模式成像扫描CY2，Cy3标记或Cy5。
- 比较膜组分，细胞质组分和非分割的样品使用DeCyder的2 - D差异分析软件 4现场的地图。
染色后
- 成像后，银染凝胶，按照标准程序 5 。
蛋白质鉴定
- 种植，收获，清洗和裂解制备金额（约1毫克总蛋白的10 x106 CHO细胞）的细胞，作为一个非分割的样本以上。使用作为秒杀一个Cy5的细胞表面标记的样本（见上文），并适用于蛋白质的不知名的制备金额一起。
- 开展上文所述的2 - D电泳，但这个时候，aplly 600微克未标记的细胞裂解液50微克的细胞表面标记的阳极杯应用穗。使用参考标记，以便正确的现场采摘，到位之间的凝胶铸造前玻璃板根据建议3。
- Cy5的通道扫描凝胶获得了Cy5的细胞表面的现场图，总蛋白染色用深紫色的总蛋白染色3。
- 搭配在一起的两个当场地图使用DeCyder 2 - D软件，并创建一个对应的赛扬5标记的细胞表面蛋白的所有景点的选择列表。选择使用Ettan当场处理站的细胞表面蛋白，提取凝胶插头，trypsinate使用Ettan沼气池。确定使用MALDI - TOF质谱。
表1。Ettan DIGE实验使用耗尽标记的细胞表面蛋白在图1的标签协议，从血清细胞样本。
| 样品 | 血清枯竭的时间 | 标记的与CyDye | 凝胶数量 |
| 1 | - | 赛扬3，赛扬2 | 1 |
| 2 | 30分钟 | 5赛扬，赛扬2 | 1 |
| 3 | 2个小时 | 赛扬3，赛扬2 | 2 |
| 4 | 4个小时 | 5赛扬，赛扬2 | 2 |
| 5 | 16个小时 | 5赛扬，赛扬2 | 3 |
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Discussion
蛋白质浓度
概述两个标签工作流程如图1所示。根据细胞表面蛋白标签协议标记时，由于细胞仍然完好，只在细胞表面的蛋白质暴露的染料。在标准Ettan DIGE协议，细胞裂解之前，标签和内以及在细胞外的蛋白质标记（图1）。染料相对量的蛋白质在细胞表面的蛋白标记协议是不知道，因为细胞表面蛋白无法具体定量分析。然而，它是已知的细胞表面蛋白2细胞蛋白构成的比例非常低。约5-10 × 10 6细胞，600 pmol染料使用。它可能会使用较少的细胞，因为在本研究nonfractionated样本中，只有12.5-25％用于2 - D电泳。
图1。标签工作流程协议概述
使用的2 - D的定量试剂盒测定蛋白浓度在不同的分数。从10 × 10 6 CHO - K1细胞的总蛋白量是920微克，在非分割的样本在胞浆/亲水性组分的膜/疏水组分和770微克， 225微克。这些款项将最有可能取决于细胞类型和细胞大小而有所不同。是在细胞表面的协议标记的蛋白质的比例可能会高于标准Ettan DIGE最小标签，这是总蛋白的2-3％。它似乎只有一个染料分子附着每个蛋白质分子，因为现场的形状是圆形和垂直裸奔的低分子量蛋白凝胶缺席（图2和3）。两个以上的蛋白质的染料分子会导致垂直条纹，由于增加了标记的蛋白质的分子量。这种现象主要与低分子量的蛋白质，因为在这些蛋白质的分子量变化会导致在一个较大的转变相比，超高分子量蛋白凝胶。
细胞表面蛋白的特定标签
两个相同的细胞样品表面标记CyDye DIGE Fluor公司Cy3标记。一个被裂解，并直接用于2 - D电泳。其他样品溶解到细胞膜和细胞质组分分馏。整个荧光标记出现在膜中的一小部分;胞浆中的一小部分是没有任何标记的蛋白（图2）。与胞质蛋白样品的凝胶银染结果表明，凝胶中的蛋白质，但他们没有使用的细胞表面蛋白标签协议标记。这些结果表明，这种新的标签协议是针对细胞表面的蛋白质。 CyDye DIGE Fluor公司最小的染料没有出现透过细胞膜进入细胞或通过。这些细胞保存在冰的标签之前，这可能降低运输穿过细胞膜任何。 CyDye DIGE Fluor公司最小的染料暴露的时间也比较短（20分钟），这是足够的蛋白质标记，但不进入细胞。另一种可能的解释是缺乏细胞内的标签，即使染料穿过细胞膜时，细胞内的pH值过低（<pH值7.4）一个高效的标记反应的发生（最佳pH值8.5）。标记反应是淬火的细胞，从而进一步防止任何蛋白标记的细胞已被溶解后清洗。该方法已成功地应用于体外培养的人类细胞株，以及一个复杂的生物系统在体内 7 。
图2。特异性细胞表面蛋白标记。
cellsurface CHO - K1细胞蛋白标记Cy3和分割。不同的分数分别为2 - D电泳分离和Cy3标记荧光扫描（一）。同样的凝胶，然后银染（二）。
分馏
有细微差别膜分割样本nonfractionated样品（图2）相比，在现场模式。两个当场地图相比，使用DeCyder 2 - D差异分析软件和所有检测点在膜中的一小部分在非分割的样本中也存在。分馏，因此，是不是要提高检测细胞表面的蛋白质，但可以用来验证缺乏蛋白质在细胞内的标签。
协议之间的比较
为了能够评价的优势与新的细胞表面亲蛋白标签协议，比较的标准Ettan DIGE协议进行。 CHO - K1细胞生长在同一瓶中的两个相同的样品在两个不同的协议，分别为（图1）平行标记。一个细胞表面Cy5标记样品上运行相同的凝胶作为Cy3标记标记的细胞裂解液。绿色斑点在凝胶（Cy3标记）（图3A）代表标记使用的标准Ettan DIGE膜分离过程的蛋白质。这点大概是膜蛋白，包括细胞表面的蛋白质以及细胞膜内的蛋白质（ER，高尔基体，线粒体和细胞核）。被选定为比较标准Ettan DIGE标记过程的膜分离步骤，因为它应该给检测低丰度的细胞表面蛋白的概率最高。的红色斑点，凝胶（图3A）（CY 5）使用新的细胞表面蛋白的标签协议程序（绿点）标准的标签不可见的标记细胞表面的特定蛋白质。此外，黄点代表重叠发生在使用任一过程（图3A）的两个样品的蛋白质。另一个有用的应用程序，将两者结合起来的标签协议，以区分从这些细胞内的膜的细胞表面的蛋白质。此外，对各种刺激后细胞表面/膜蛋白水平的相对变化的信息，随后可同时使用两种标记技术。
图3。
（一）的2 - D凝胶图像一个CHO - K1的Cy5的细胞表面标记的样品（红色斑点，见协议1，图1）和膜分割Cy3标记的样本（绿色斑点，见协议2，图1）标记根据标准Ettan DIGE协议运行在相同的2 - D凝胶。 （二）DeCyder 2 - ð差分分析软件，从一个细胞表面的标记蛋白不可见的，使用的标准Ettan DIGE协议的2 - D凝胶意见。
细胞表面蛋白的识别
由于现货模式是一个细胞表面标记的样品和总蛋白标记的样本之间非常不同，它是必要的，包括细胞表面标记的扣球，使在细胞表面有黑斑的制备当场地图匹配和识别。所有的细胞表面蛋白回升。细胞表面的蛋白质，可难以确定，因为他们的低丰度。在一些景点的实际蛋白质的数量可能不足以识别，因为细胞表面的蛋白质在视觉上丰富，而不是物理丰富，使用此协议。为了便于低丰度的细胞表面蛋白的成功鉴定，总蛋白的制备金额可以丰富申请前2 - D电泳膜蛋白。在这些CHO细胞，细胞内的膜蛋白与细胞表面的蛋白质构成的总蛋白在细胞中大约20％。对于这种类型的细胞，在斑点的蛋白质的量可能增加的一个因素5膜蛋白的富集。另外，使用窄梯度IPG胶条的pH值间隔将允许较大数额的蛋白质申请。在这项研究中，我们只用了600μg总蛋白，没有膜蛋白的浓缩，一个范围广泛的IPG胶条。我们仍然能够识别大量的细胞表面的蛋白质，其中82％以前被称为膜相关蛋白。
复
为了测试细胞表面蛋白Ettan DIGE实验中使用的所有三种染料，一系列血清耗尽CHO细胞在不同时间点（见表1）收集和细胞表面的蛋白标记的样品 6的标签协议。样品通过2 - D电泳分离。细胞表面DIGE实验的内部标准的准备工作很简单。在这种情况下，赛扬2细胞表面标记的样品（从所有的时间点）合并，并作为内部标准适用于每一个2 - D凝胶。同样所有三个CyDye DIGE Fluor公司最小的染料标记细胞表面蛋白（数据未显示）。使用DeCyder 2 - D软件（图4）检测血清饥饿在许多细胞表面的蛋白质表达的变化。
图4。
在两个细胞表面蛋白的表达变化在CHO - K1细胞的饥饿。现货地图使用DeCyder的2 - D差异分析软件进行分析。
结论
新Ettan DIGE细胞表面的蛋白标记的协议是快速，简单到uSE和高度标记细胞表面蛋白的具体。许多新的细胞表面蛋白仅可检测时使用的细胞表面蛋白标签协议。超过80个地CHO细胞新的细胞表面的蛋白质进行检测，使用DeCyder的2 - D差异分析软件。确定细胞表面标记点超过80％的膜相关蛋白。
复用是通过使用三个CyDye DIGE Fluor公司最小的染料，并结合DeCyder 2 - D软件，这个新的协议是一个用于研究细胞表面蛋白的2 - D DIGE技术获得的所有优势强大的工具。
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Acknowledgments
我们感谢他们的合作，奥地利维也纳大学临床病理研究所教授Dontscho Kerjaschki，科里纳Mayrhofer和Sigurd克里格。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
