Summary
Eine einfache und spezifische Methode wurde für Fluoreszenzmarkierung und verbesserte Erkennung von Zelloberflächen-Proteine ohne Fraktionierung Schritt demonstriert. Differential Fülle in Zelloberflächenproteine wurde mittels zweidimensionaler (2-D)-Elektrophorese und Ettan ™ DIGE Technologie.
Abstract
Oberflächen-Proteine sind von zentraler Bedeutung für die Fähigkeit der Zelle auf ihre Umwelt reagieren und mit den benachbarten Zellen zu interagieren. Sie sind dafür bekannt, Induktoren von fast allen intrazelluläre Signalwege werden. Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle im Umweltschutz Anpassung und medikamentöse Behandlung, und sind oft in der Krankheitsentstehung und die Pathologie (1) beteiligt. Protein-Protein-Wechselwirkungen sind untrennbar mit Signalwegen, und einen tieferen Einblick in diese komplexe biologische Prozesse zu gewinnen, sind empfindlicher und zuverlässiger Methoden zur Untersuchung von Zelloberflächen-Proteine benötigt werden. Zweidimensionale (2-D)-Elektrophorese wird weitgehend für den Nachweis von Biomarkern und anderen Zielen in komplexen Protein-Proben, um differentielle Änderungen Studie verwendet. Zelloberflächenproteine, teils wegen ihrer geringen Menge (1 2% der zellulären Proteine) sind schwierig, in einem 2-D Gel ohne Fraktionierung oder eine andere Art der Bereicherung zu erkennen. Sie sind auch oft schlecht in 2-D Gelen aufgrund ihrer hydrophoben Natur und mit hohem Molekulargewicht (2) vertreten. In dieser Studie präsentieren wir ein neues Protokoll für intakte Zellen mit CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe zur spezifischen Markierung und Erkennung von dieser wichtigen Gruppe von Proteinen. Die Ergebnisse zeigten, spezifische Markierung von einer großen Anzahl von Zelloberflächen-Proteine mit minimalen Kennzeichnung von intrazellulären Proteinen. Dieses Protokoll ist eine schnelle, einfach zu bedienen, und alle drei CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffen (Cy 2, Cy 3 und Cy 5) kann verwendet werden, um Zelloberflächen-Proteine zu markieren. Diese Funktionen ermöglichen zum Multiplexen mit der 2-D-Fluoreszenz Difference Gel-Elektrophorese (2-D DIGE) mit Ettan DIGE Technologie und Analyse der Proteinexpression Änderungen mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Die Höhe der Zelloberfläche Proteine wurde während Serumentzug von CHO-Zellen für verschiedene Zeitspannen (siehe Tabelle 1). Kleine Veränderungen in Hülle und Fülle wurden mit hoher Genauigkeit erfasst und die Ergebnisse sind definiert durch statistische Methoden unterstützt.
Protocol
Zellkultur
- Wachsen Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1) mit Standard-Zellkultur Verfahren in F-12 Ham Medium mit Glutamax I mit 10% fötalem Kälberserum, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin-Sulfat (Invitrogen).
- Austausch des Kulturmediums auf serum-freien Medien. Beschriften Sie die Zelloberfläche Proteine wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit CyDye DIGE Fluor Cy3 oder Cy5 minimal Farbstoffe (siehe Abschnitt Cell Surface Labeling, unten).
- Pool gleiche Anzahl von Zellen, die aus jedem Zeitpunkt und Etikett mit CyDye DIGE Fluor Cy2. Verwenden Sie diese als interner Standard für die einzelnen 2-D-Gel.
- Die Mehrzahl der Experimente lassen sich mit CHO-K1-Zellen durchgeführt werden, sondern Maus-Embryo-Fibroblasten (3T3 L1) und Maus-Aszites-Lymphom Lymphoblasten (EL4) können ebenfalls verwendet werden (Daten nicht gezeigt).
- Wachsen die beiden letzteren Zelltypen in DMEM-Medium mit Glutamax II, aber sonst identische Bedingungen für die CHO-K1-Zellen verwendet.
Zelloberfläche Kennzeichnung
- Vorsichtig lösen adhärente Zellen nicht-enzymatisch, Zählung und Einteilung in Aliquots von 5-10 x106 Zellen. Für in Suspension wachsenden Zellen, lassen die Ablösung Schritt.
- Centrifuge die Zellsuspensionen bei etwa 800 xg für 5 Minuten. Entfernen Sie die Überstände mit dem Medium.
- Waschen Sie die Pellets durch resuspendion in Balanced Salt 1 ml eiskalter Hanks Solution (HBSS) pH 8,5. Zentrifugiert bei 800 xg bei 4 ° C für 2 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 200 ul eiskaltem Kennzeichnung Puffer (HBSS pH 8,5, 1 M Harnstoff).
- Beschriften Sie die intakten Zellen mit 600 pmol CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln.
- Die Reaktion wird durch Zugabe von 20 ul 10 mM Lysin. Inkubieren für 10 Minuten.
- Waschen Sie die Oberfläche-markierten Zellen zweimal durch Resuspension in 500 ul HBSS pH 7,4, durch Zentrifugation bei 800 xg bei 4 ° C für 2 Minuten.
Zelllyse und Fraktionierung
- Lyse der Oberfläche-markierten Zellen in 150 ul kaltem Lysepuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM Magnesium-Acetat pH 8,5). Lassen Sie auf dem Eis für mindestens 1 h mit gelegentlichen Vortexen.
- Centrifuge die Lysate bei 10 000 xg bei 4 ° C für 5 Minuten. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Dieses Beispiel ist die nicht-fraktionierten Probe mit allen zellulären Proteinen.
- In parallel, waschen Zellpellets, wie oben, dann fraktionieren (unter Verwendung einer Membran-Fraktionierung Kit, Pierce) in Membran-und zytosolischen Fraktionen vor 2-D-Gelelektrophorese. Die Membranfraktion enthält interne und Zelloberfläche Membranproteinen.
- Zum Vergleich, folgen Sie den Standard-Ettan DIGE Verfahren 3 und lysieren, label, und schließlich Fraktionierung der Zellen. Bestimmen Sie die Protein-Konzentration in den Proben mit den 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).
2-D Elektrophorese
- Rehydrieren Immobiline DryStrip Gele, pH 3-11NL (24 cm) mit Immobiline DryStrip Reswelling Tablett, 24 cm in 450 ul Strichen Rehydration-Lösung (0,5% IPG-Puffer) über Nacht.
- Übernehmen Sie die CyDye-markierten Proben (entsprechend 50 ug Gesamt-Protein), um DryStrip Gele durch anodische cup loading in die vielfältigen Immobiline und führen isoelektrische Fokussierung (IEF) mit Ettan IPGphor II IEF-System gemäß den Anweisungen.
- Nach IEF, bringen die Streifen in zwei Schritten und Platz auf der großen (26 x 20 cm) 12,5% igen Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE). Overlay mit 0,5% Agarose (in Laufpuffer mit Bromphenolblau). Run 2-D Elektrophorese mit Ettan DALTtwelve Large Vertical-System mit 5 W / Gel für 30 min und dann bei 15 W / Gel bis der Farbstoff vor Erreichen der Unterseite des Gels.
Imaging und Datenanalyse
- Nach Abschluss 2-D-Elektrophorese, scannen Sie die Gele für Cy2, Cy3 oder Cy5 mit einem Typhoon 9410 Variable Modus Imager.
- Vergleichen Sie vor Ort Karten von Membranfraktionen, cytosolischen Fraktionen, und nicht-fraktionierten Proben mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software 4.
Post-Färbung
- Nach der Bebilderung Silberfärbung der Gele nach Standardverfahren 5.
Protein Identifikation
- Anbauen, ernten, waschen und zu lysieren präparativen Mengen (etwa 1 mg Gesamt-Protein von 10 x106 CHO-Zellen) von Zellen, wie oben für eine nicht-fraktionierten Probe beschrieben. Verwenden Sie ein Cy5 Zelloberfläche markierten Probe (siehe oben) als Spitze und gelten zusammen mit dem unmarkierten präparative Mengen an Protein.
- Führen Sie 2-D-Elektrophorese, wie oben beschrieben, aber dieses Mal, aplly 600 ug unmarkierte Zellen zusammen Lysat mit 50 ug Zelloberfläche gekennzeichnet Spike durch anodische cup Anwendung. Verwenden Sie Referenzmarken zu richtigen Stelle Kommissionierung zu ermöglichen, und legen Sie werdenzwischen den Glasplatten vor Gelgießen nach Empfehlungen 3.
- Scannen Sie das Gel in Cy5 Kanal zum Cy5 Zelloberfläche Spotkarten von insgesamt Proteinanfärbung mit Deep purple Gesamtprotein Fleck 3, gefolgt erhalten.
- Spiel zusammen die beiden vor Ort Karten mit dem DeCyder 2-D-Software und erstellen Sie eine Auswahlliste für alle Flecken entsprechend der Cy 5 beschriftet Zelloberflächenproteine. Wählen Zelloberflächenproteine mit dem Ettan Ort Handling-Station, aus dem Gel-Stecker herausziehen und abtrypsinieren mit dem Ettan digester. Identifizieren mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie.
Tabelle 1. Ein Ettan DIGE Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung von Proben aus dem Serum verbraucht Zellen markiert nach der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll in Abb. 1 dargestellt.
| Probe | Die Zeit des Serum-Depletion | Labelled mit CyDye | Gel-Nummer |
| 1 | - | Cy 3, Cy 2 | 1 |
| 2 | 30 Minuten | Cy 5, Cy 2 | 1 |
| 3 | 2 Stunden | Cy 3, Cy 2 | 2 |
| 4 | 4 Stunden | Cy 5, Cy 2 | 2 |
| 5 | 16 Stunden | Cy 5, Cy 2 | 3 |
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Discussion
Protein-Konzentration
Eine Übersicht über die beiden Kennzeichnung Workflows ist in Abbildung 1 dargestellt. Da die Zellen noch intakt sind, wenn sie gemäß der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll bezeichnet, werden nur die Zelloberflächenproteine, um den Farbstoff ausgesetzt. In der Standard-Ettan DIGE-Protokoll werden die Zellen lysiert vor der Etikettierung und Proteinen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle gekennzeichnet sind (Abb. 1). Die relative Menge des Farbstoffs an Protein in der Zelle-Oberfläche Proteinmarkierung Protokoll ist nicht bekannt, da der Zelloberfläche Proteine können nicht ausdrücklich quantifiziert werden. Es ist jedoch bekannt, dass Zelloberflächenproteine einen sehr geringen Anteil der zellulären Proteine 2 bilden. Etwa 5-10 x10 6 Zellen zu 600 pmol von Farbstoff verwendet wurden. Es kann möglich sein, weniger Zellen verwenden, da nur 12,5 bis 25% der nonfractionated Probe in dieser Studie für 2-D-Elektrophorese verwendet wurde.
Abb. 1. Übersicht über die Kennzeichnung Workflow-Protokolle
Protein-Konzentrationen in den verschiedenen Fraktionen wurden unter Verwendung der 2-D Quant Kit. Die Gesamt-Protein Menge von 10 x10 6 CHO-K1-Zellen abgeleitet wurde 920 pg in der nicht-fraktionierten Probe, 225 mg in der Membran / hydrophob-Anteil und 770 mg in der cytosolischen / hydrophile Fraktion. Diese Beträge werden wahrscheinlich je nach Zelltyp und der Zellgröße. Der Anteil von Proteinen, die in der Zell-Oberfläche Protokoll gekennzeichnet sind, können höher sein als die Standard-Ettan DIGE minimal Etikettierung, die 2-3% des gesamten Proteins ist. Es scheint, dass nur ein Farbstoff-Molekül pro Proteinmolekül gebunden ist, da der Ort ist rund und vertikale Streifenbildung der niedermolekularen Proteine auf den Gelen fehlt (Abb. 2 und 3). Zwei und mehr Farbstoffmoleküle pro Protein würde vertikale Streifenbildung durch erhöhte Molekulargewicht des markierten Proteins. Dieses Phänomen würde vor allem mit den Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht angesehen werden, da eine Änderung in Molekulargewicht dieser Proteine in einer größeren Verschiebung auf das Gel im Vergleich zu Proteinen mit hohem Molekulargewicht ergeben würde.
Zelloberflächenprotein spezifische Etikettierung
Zwei identische Proben von Zellen wurden Oberfläche mit CyDye DIGE Fluor Cy3 markiert. Einer war aufgeschlossen und direkt für die 2-D-Elektrophorese verwendet. Die andere Probe wurde lysiert und fraktionierte in Membran-und zytosolischen Fraktionen. Die gesamte Fluoreszenzmarkierung erschien in der Membranfraktion, die cytosolische Fraktion wurde ohne jede markierte Proteine (Abb. 2). Das gleiche Gel mit dem zytosolischen Protein-Probe wurde Silber gefärbt und das Ergebnis zeigte, dass es Proteine im Gel, aber sie waren nicht beschriftet mit dem Zell-Oberflächen-Protein Kennzeichnung Protokoll. Diese Ergebnisse legen nahe, dass diese neue Kennzeichnung Protokoll spezifisch für Zelloberflächenproteine ist. Die CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoff erscheint nicht auf die Zelle oder durchqueren die Zellmembran gelangen. Die Zellen werden auf Eis vor der Kennzeichnung und behielt diese kann jeder Transport über die Membran zu reduzieren. Die Zeit für CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoff Exposition ist auch relativ kurz (20 Minuten), was ausreichend ist für Protein-Kennzeichnung, aber nicht für die Einreise in die Zelle. Eine weitere mögliche Erklärung für das Fehlen der Kennzeichnung innerhalb der Zelle ist, dass selbst wenn der Farbstoff geht durch die Membran, den pH-Wert in der Zelle zu niedrig (<pH 7,4) ist für eine effiziente Kennzeichnung Reaktion auftritt (pH-Optimum 8,5). Die Kennzeichnung Reaktion abgeschreckt gefolgt von einem Waschen der Zellen, die weiter verhindert Proteinmarkierung, nachdem die Zellen haben lysiert worden. Diese Methode wurde erfolgreich an menschlichen Zelllinien in vitro als auch ein komplexes biologisches System in vivo 7 angelegt.
Abb. 2. Spezifität von Zelloberflächen-Protein Kennzeichnung.
Die cellsurface Proteine von CHO-K1-Zellen wurden mit Cy3 und fraktionierte gekennzeichnet. Die verschiedenen Fraktionen wurden durch 2-D-Elektrophorese aufgetrennt und gescannt Cy3-Fluoreszenz (A). Das gleiche Gele wurden dann Silber gefärbt (B).
Die Fraktionierung
Es gibt nur geringe Unterschiede in der Punktmuster für die Membran-fraktionierten Probe im Vergleich zu den nonfractionated Probe (Abb. 2). Die beiden vor Ort Karten wurden mit Hilfe DeCyder 2-D Differential Analysis Software und alle Punkte in der Membranfraktion nachgewiesen wurden auch in der nicht fraktionierten Probe. Die Fraktionierung ist also nicht notwendig, um den Nachweis von Zelloberflächen-Proteine zu verbessern, kann aber verwendet werden, um fehlende Markierung von Proteinen innerhalb der Zellen zu überprüfen.
Vergleich zwischen den Protokollen
Um die Vorteile der neuen Zelloberfläche pro bewertentein Kennzeichnung Protokoll, ein Vergleich mit der Standard-Ettan DIGE Protokoll durchgeführt wurde. Zwei identische Proben von CHO-K1-Zellen in der gleichen Flasche angebaut wurden parallel mit den beiden unterschiedlichen Protokollen, bzw. (Abb. 1) gekennzeichnet. Ein Zelloberflächen-Cy5 markierten Probe wurde auf dem gleichen Gel als Cy3 markierten Zelllysat laufen. Die grünen Flecken (Cy3) auf dem Gel (Abb. 3A) stellen die Proteine gekennzeichnet mit dem Standard-Ettan DIGE Verfahren durch Membran-Fraktionierung. Diese Flecken sind vermutlich Membranproteine einschließlich Zelloberfläche Proteine sowie Proteine aus Membranen innerhalb der Zelle (ER, Golgi, Mitochondrien und Zellkern). Standard Ettan DIGE Kennzeichnung Verfahren durch eine Membran-Fraktionierung Schritt folgte, war für den Vergleich gewählt, da sie die höchste Wahrscheinlichkeit zur Erkennung der niedrigen reichlich Zelloberflächenproteine geben sollte. Die roten Flecken (Cy 5) auf dem Gel (Abb. 3A) sind Zelloberfläche spezifische Proteine gekennzeichnet mit dem neuen Zelloberflächenprotein Kennzeichnung Protokoll, das nicht sichtbar sind mit dem Standard-Kennzeichnung Verfahren (grüne Punkte). Darüber hinaus stellen die gelben Flecken überlappenden Proteinen, die in beiden Proben mit beiden Verfahren (Abb. 3A) auftreten. Eine weitere nützliche Anwendung ist sowohl für die Kennzeichnung Protokolle an Proteine auf der Zelloberfläche von denen auf intrazellulären Membranen unterscheiden zu kombinieren. Darüber hinaus könnten Informationen über relative Veränderungen in der Zelloberfläche / membrane protein-Spiegel nach verschiedenen Stimuli, indem sowohl die Kennzeichnung Techniken gleichzeitig verfolgt werden.
Abb. 3.
(A) 2-D Gel-Bilder einer CHO-K1 Cy5 Zelloberflächen-markierten Proben (rote Punkte, siehe Protokoll 1, Abb. 1) und einer Membran fraktionierte Cy3 Probe (grüne Punkte, siehe Protokoll 2, Abb. 1) beschriftet nach Standard Ettan DIGE-Protokoll in der gleichen 2-D-Gel laufen gelassen. (B) DeCyder 2-D Differential Analysis Software Aussicht von der 2-D-Gel zeigt eine Zell-Oberflächen-markierten Proteins nicht sichtbar unter Verwendung des Standard Ettan DIGE-Protokoll.
Identifizierung von Zelloberflächenproteine
Da der Spot-Muster ist sehr unterschiedlich zwischen einer Zelloberfläche markierten Probe und einer Gesamt-Protein markierte Probe, war es notwendig, ein Zelloberflächen gekennzeichnet spike, um passende und Identifizierung der Zelloberfläche Flecken in der präparativen Spotkarten ermöglichen, einschließen. Alle Zelloberfläche Proteine wurden abgeholt. Zelloberflächenproteine kann schwierig sein, zu erkennen auf Grund ihrer geringen Hülle und Fülle. Die tatsächlichen Proteinmenge an einigen Stellen möglicherweise nicht zur Identifikation, da die Zelloberflächenproteine visuell bereichert und nicht physisch bereichert dieses Protokoll verwenden. Zur Erleichterung der erfolgreichen Identifikation der niedrigen reichlich Zelloberflächenproteine, kann die präparative Mengen an Gesamt-Protein für Membranproteine vor der Anwendung werden auf 2-D Elektrophorese bereichert. In dieser CHO-Zellen, bilden intrazellulären Membranproteinen und Zelloberflächenproteine ca. 20% des gesamten Proteins in den Zellen. Aus diesem Zelltyp konnte die Proteinmenge in den Spots möglicherweise um einen Faktor 5 durch Anreicherung von Membranproteinen erhöht werden. Auch die Verwendung von engen Gradienten pH Intervalle der IPG-Streifen ermöglichen die Anwendung von größeren Mengen an Protein. In dieser Studie haben wir nur 600 ug Gesamt-Protein, ohne Bereicherung für Membranproteine, und eine breite Palette IPG-Streifen. Wir waren noch in der Lage, eine große Anzahl von Zelloberflächen-Proteine, von denen 82% zuvor als Membran assoziierten Proteine bekannt waren zu identifizieren.
Multiplexing
Zum Testen der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll in einer Ettan DIGE Experiment unter Verwendung aller drei Farbstoffe 6, eine Reihe von Proben aus dem Serum verbraucht CHO-Zellen wurden gesammelt und Zelloberflächenproteine beschriftet zu verschiedenen Zeitpunkten (Tabelle 1). Die Proben wurden durch 2-D-Elektrophorese aufgetrennt. Die Vorbereitung eines internen Standards für ein Zelloberflächen-DIGE Experiment ist einfach. In diesem Fall wurden Cy 2 Zelloberfläche markierten Proben (aus allen Zeitpunkten) gebündelt und als interner Standard an jeder 2-D-Gel. Alle drei CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffen markiert Zelloberflächenproteine ähnlich (Daten nicht gezeigt). Änderungen in Expression während Serumentzug für viele Zelloberflächenproteine wurden unter Verwendung von DeCyder 2-D-Software (Abb. 4).
Abb. 4.
Veränderung der Expression von zwei Zell-Oberflächen-Proteine während der Hungersnot von CHO-K1-Zellen. Spot-Karten wurden mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software.
Schlussfolgerungen
Die neue Ettan DIGE Protokoll für Zelloberflächenprotein Kennzeichnung ist schnell, einfach use und hochspezifisch für die Kennzeichnung Zelloberflächenproteine. Viele neuartige Zelloberfläche Proteine sind nur nachweisbar, wenn Sie die Zelloberflächenprotein Kennzeichnung Protokoll. Über 80 neue Zell-Oberflächen-Proteine für CHO-Zellen wurden unter Verwendung von DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Über 80% der identifizierten Zelloberfläche gekennzeichnet Spots wurden Membran-assoziierten Proteinen.
Multiplexing erfolgt über die drei CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe, und in Kombination mit DeCyder 2-D-Software, ist dieses neue Protokoll ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Zell Oberflächenproteine mit allen Vorteilen der 2-D DIGE-Technologie erhalten.
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Acknowledgments
Wir danken Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer und Sigurd Krieger am Institut für Klinische Pathologie, Universität Wien, Österreich für ihre Mitarbeit.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
