Summary
שיטה פשוטה ספציפי הודגם תיוג פלורסנט וזיהוי מוגברת של חלבונים פני התא ללא צעד חלוקה. שפע דיפרנציאלי חלבונים פני התא נותח באמצעות אלקטרופורזה דו מימדי (2-D) ו Ettan טכנולוגיית ™ DIGE.
Abstract
חלבונים Surface הם מרכזי ביכולתו של התא להגיב על סביבתו כדי אינטראקציה עם תאים שכנים. הם ידועים להיות מעוררים כל איתות של כמעט תאיים. יתרה מזאת, הם ממלאים תפקיד חשוב בהתאמת הסביבה טיפול תרופתי, לעתים קרובות מעורבים בהיווצרות המחלה והפתולוגיה (1). חלבונים הם אינטראקציות מהותי מסלולי איתות, ולקבל תובנה יותר אלה תהליכים ביולוגיים מורכבים, שיטות רגיש ואמין יש צורך ללמוד משטח חלבונים בתא. דו מימדי (2-D) אלקטרופורזה נעשה שימוש נרחב לגילוי של סמנים ביולוגיים ויעדים אחרים בדגימות חלבון מורכב ללמוד שינויים ההפרש. שטח פני התא חלבונים, בין היתר בשל שפע הנמוכה שלהם (1 2% של חלבונים תאיים), קשה לזהות בתוך ג'ל 2-D ללא חלוקה או סוג אחר של העשרה. לעתים קרובות הם גם ייצגו גרוע 2-D ג'לים בשל אופי הידרופובי שלהם משקל מולקולרי גבוה (2). במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדש של תאים שלמים באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי עבור תיוג זיהוי ספציפי של קבוצה חשובה זו של חלבונים. התוצאות הראו תיוג ספציפית של מספר רב של חלבונים פני התא עם תיוג מינימלי של חלבונים תאיים. פרוטוקול זה הוא מהיר, פשוט לשימוש, וכל שלושת CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי (סי 2, סי 3 וסי 5) ניתן להשתמש בתווית על פני קרום התא חלבונים. תכונות אלו מאפשרות ריבוב באמצעות 2-D ההבדל Fluorescence ג'ל אלקטרופורזה (2-D DIGE) עם טכנולוגיית DIGE Ettan וניתוח של שינויים בביטוי החלבונים באמצעות DeCyder 2-D ניתוח תוכנה דיפרנציאלי. רמת פני קרום התא חלבונים לוותה במהלך רעב סרום של תאים CHO עבור אורכי זמן שונים (ראה טבלה 1). שינויים קטנים שפע התגלו עם דיוק גבוה, והתוצאות נתמכים על ידי שיטות סטטיסטיות מוגדר.
Protocol
תא תרבות
- לגדל אוגר סיני השחלות תאים (CHO-K1) באמצעות תקן תרבות נהלים תא בינוני F-12 חם עם GlutaMAX אני המכילה 10% נסיוב עגל עוברית, 50 U / ml פניצילין, ו -50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין סולפט (Invitrogen).
- הבורסה בינוני תרבות סרום ללא התקשורת. התא תווית חלבונים פני השטח היו בנקודות זמן שונות עם CyDye DIGE פלואוריד Cy3 או Cy5 צבעים מינימלי (ראה סעיף Cell Surface תיוג, להלן).
- בריכת מספר שווה של התאים מנקודת כל הזמן עם תווית CyDye DIGE פלואוריד Cy2. השתמש אלה כסטנדרט פנימי עבור ג'ל 2-D כל אחד.
- רוב הניסויים ניתן לבצע עם CHO-K1 תאים, אבל העובר עכבר fibroblasts (L1 3T3) ו מיימת עכבר לימפומה lymphoblasts (EL4) יכול גם בשימוש (מידע לא מוצג).
- לגדל את שני סוגי התאים האחרונים ב DMEM בינוני עם GlutaMAX השנייה, אבל, אחרת, השתמש התנאים זהים המשמשים את CHO-K1 תאים.
משטח נייד תיוג
- בזהירות לנתק תאים חסיד שאינו enzymatically, לספור חלוקת לתוך aliquots של x106 תאים 5-10. עבור תאים הגדלים ההשעיה, להשמיט את הצעד ניתוק.
- צנטריפוגה השעיות התא XG על 800 במשך 5 דקות. הסר את supernatants המכיל את המדיום.
- לשטוף את כדורי ידי resuspendion בתוך תמיסת מלח מאוזן 1 מ"ל קרח קר של האנק (HBSS) pH 8.5. Centrifuged ב XG 800 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 200 μl חיץ תיוג קרים כקרח (HBSS pH 8.5, 1 M אוריאה).
- לייבל בתאים שלמים עם 600 pmol CyDye צבעים DIGE פלואוריד מינימלית במשך 20 דקות על הקרח בחושך.
- להרוות את התגובה על ידי הוספת 20 μl 10 mM ליזין. דגירה במשך 10 דקות.
- שטפו את פני השטח שכותרתו תאים פעמיים resuspension ב-pH 500 HBSS μl 7.4, ואחריו צנטריפוגה ב XG 800 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
Cell ו תמוגה חלוקה
- Lyse את פני השטח שכותרתו תאים חיץ תמוגה μl 150 קרים (7 אוריאה M, 2 M thiourea, בחורים 4%, 30 מ"מ טריס, 5 mM מגנזיום אצטט pH 8.5). השאירו על הקרח עבור שעות לפחות 1 עם vortexing מזדמנים.
- צנטריפוגה lysates XG ב 000 10 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מעבירים את supernatant לצינור חדש. מדגם זה הוא מדגם שאינם מופרדים המכיל את כל חלבוני התא.
- במקביל, לשטוף כדורי התא, כאמור לעיל, fractionate אז (באמצעות ערכת חלוקה קרום, פירס) לתוך הממברנה שברים cytosolic לפני ג'ל אלקטרופורזה 2-D. חלק הממברנה מכילה פנימיים קרום התא חלבונים השטח.
- לשם השוואה, בצע את ההליך הסטנדרטי Ettan DIGE 3, lyse, התווית, ולבסוף, fractionate התאים. קביעת ריכוז חלבון בדגימות באמצעות 2 - ד קוואנט Kit (GE Healthcare).
2-D אלקטרופורזה
- רעננותם ג'לים Immobiline DryStrip, pH 3-11NL (24 ס"מ) באמצעות מגש DryStrip Immobiline Reswelling, 24 ס"מ 450 פתרון DeStreak μl Rehydration (0.5% IPG Buffer) לילה.
- החל את CyDye שכותרתו דגימות (המקביל ל 50 מיקרוגרם חלבון בסה"כ) כדי Immobiline ג'לים DryStrip ידי טעינת כוס anodic ב סעפת ולבצע התמקדות isoelectric (IEF) באמצעות Ettan IPGphor מערכת II IEF על פי ההוראות.
- לאחר IEF, לאזן את רצועות בשני שלבים ומקום על גבי (26 x 20 ס"מ) ג'לים גדול polyacrylamide 12.5% (SDS-PAGE). שכבת עם agarose 0.5% (בניהול מאגר המכיל כחול bromophenol). Run 2-D באמצעות אלקטרופורזה Ettan מערכת DALTtwelve אנכי גדול ב 5 W / ג'ל למשך 30 דקות ולאחר מכן ב 15 W / ג'ל עד בחזית לצבוע מגיע לתחתית הג'ל.
הדמיה וניתוח נתונים
- לאחר השלמת 2-D אלקטרופורזה, לסרוק את הג'לים עבור Cy2, Cy3 או Cy5 באמצעות Imager טייפון 9410 מצב משתנה.
- השווה מפות במקום שברים של הממברנה, שברים cytosolic, שאינם מופרדים באמצעות דגימות DeCyder 2-D ניתוח דיפרנציאלי תוכנה 4.
פוסט מכתים
- לאחר הדמיה, כסף הכתם ג'ל על פי הנוהל המקובל 5.
חלבון זיהוי
- לגדול, קציר, לרחוץ lyse כמויות preparative (כ 1 מ"ג חלבון הכולל 10 x106 בתאי CHO) של תאים, כפי שתואר לעיל למדגם הלא מופרדים. השתמש Cy5 פני התא מדגם שכותרתו (ראה לעיל) כמו ספייק, ולהחיל יחד עם כמויות תווית preparative של חלבון.
- ביצוע אלקטרופורזה 2-D כפי שתואר לעיל, אך הפעם, aplly תא 600 מיקרוגרם ללא תווית lysate יחד עם משטח 50 מיקרוגרם תא שכותרתו ספייק ידי יישום כוס anodic. השתמש בסמנים כדי לאפשר התייחסות לקטוף במקום הנכון, במקום להיותtween הזכוכית צלחות לפני יציקת ג'ל על פי המלצות 3.
- סרוק את הג'ל בערוץ Cy5 כדי לקבל את פני התא Cy5 נקודה במפה, ואחריו מכתים חלבון סך הכל באמצעות חלבון סגול עמוק כתם 3.
- התאמה יחד את שתי מפות נקודה באמצעות DeCyder 2-D התוכנה ליצור רשימה לבחור עבור כל המקומות המתאימים 5 סיי חלבונים השטח שכותרתו התא. פיק פני התא חלבונים באמצעות נקודה Ettan תחנת הטיפול, לחלץ את המצתים ג'ל, ו trypsinate באמצעות digester Ettan. זיהוי באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה.
טבלה 1. DIGE Ettan הניסוי בוצע באמצעות דגימות מתאי מדולדל בסרום סומנו על פי הפרוטוקול על פני קרום התא חלבון תיוג באיור 1.
| מדגם | זמן של דלדול בסרום | מדביקים לו תווית עם CyDye | ג'ל מספר |
| 1 | - | סי 3, סי 2 | 1 |
| 2 | 30 דקות | סי 5, סי 2 | 1 |
| 3 | 2 שעות | סי 3, סי 2 | 2 |
| 4 | 4 שעות | סי 5, סי 2 | 2 |
| 5 | 16 שעות | סי 5, סי 2 | 3 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ריכוז חלבון
סקירה של שני workflows תיוג מוצג באיור 1. מאז התאים הם עדיין שלם שכותרתו כאשר על פי פרוטוקול פני קרום התא תיוג חלבון, רק פני חלבונים בתא נחשפים לצבוע. ב תקן Ettan DIGE פרוטוקול, התאים lysed לפני תיוג חלבונים בתוך כמו גם מחוץ לתא מסומנים (איור 1). הסכום היחסי של צבען חלבון הפרוטוקול על פני קרום התא תיוג החלבון אינו ידוע, שכן על פני קרום התא חלבונים לא ניתן ונרשמת במיוחד. עם זאת, ידוע כי חלבונים בתא השטח מהווים אחוז נמוך מאוד של חלבונים הסלולר 2. 5-10 כ x10 6 תאים 600 pmol של צבע היו בשימוש. ייתכן שניתן יהיה להשתמש בתאי פחות מאז רק 12.5-25% מהמדגם nonfractionated במחקר זה שימש אלקטרופורזה 2-D.
איור 1. סקירה של תיוג פרוטוקולי עבודה
ריכוז חלבון של שברים שונים נקבעו באמצעות קיט 2-D קוואנט. כמות החלבון הכולל נגזר 10 x10 6 CHO-K1 התאים היה 920 מיקרוגרם במדגם הלא לפרק את, 225 מיקרוגרם של קרום מיקרוגרם / חלק הידרופובי 770 בשבריר cytosolic / הידרופילי. סכומים אלה סביר להניח להשתנות בהתאם לסוג התא גודל התא. חלקם של חלבונים מסומנים בפרוטוקול על פני קרום התא עשוי להיות גבוה יותר מאשר תיוג תקן DIGE Ettan מינימלי, שהוא 2-3% של החלבון הכולל. נראה כי רק מולקולה אחת לצבוע מצורפת לכל מולקולת חלבון, שכן צורת ספוט פסים אנכיים עגולים של חלבונים מולקולרי נמוך על הג'לים נעדר (איור 2 ו -3). שתיים ועוד מולקולות צבע לכל חלבון יגרום פסים אנכיים בשל משקל מולקולרי מוגברת של חלבון הנקרא. תופעה זו היתה בעיקר לראות עם חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך, שכן שינוי משקל מולקולרי של חלבונים אלה תביא לשינוי גדול יותר על הג'ל לעומת חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה.
על פני קרום התא חלבון ספציפי תיוג
שני מדגמים זהים של תאים היו פני תווית עם CyDye DIGE פלואוריד Cy3. אחד מהם היה lysed בשימוש ישירות על אלקטרופורזה 2-D. המדגם השני היה lysed ו מופרדים לתוך הממברנה שברים cytosolic. התווית פלורסנט כולו הופיע שבר את הממברנה, שבר cytosolic היה נטול כל החלבונים שכותרתו (איור 2). ג'ל מדגם זהה עם החלבון cytosolic היה מוכתם כסף והתוצאה הראתה כי היו החלבונים הג'ל, אבל הם לא תויגו באמצעות פני קרום התא תיוג פרוטוקול חלבון. התוצאות מראות כי בפרוטוקול זה תיוג חדש ספציפי חלבונים פני התא. DIGE CyDye לצבוע פלואוריד מינימלי אינו מופיע להיכנס לתא או לעבור דרך קרום התא. התאים מוחזקים על קרח לפני תיוג וזה עשוי להפחית כל הובלה על פני קרום. זמן חשיפה CyDye פלואוריד לצבוע DIGE מינימלי הוא גם קצר יחסית (20 דקות), אשר מספקת תיוג חלבון אך לא עבור כניסה לתוך התא. הסבר אפשרי נוסף על חוסר תיוג בתוך התא היא שגם אם הצבע עובר דרך הממברנה, ה-pH בתוך התא הוא נמוך מדי (<pH 7.4) עבור התגובה תיוג יעיל להתרחש (pH אופטימלי 8.5). התגובה תיוג הוא הרווה ואחריו כביסה של תאים, אשר מונע כל עוד תיוג חלבון אחרי התאים כבר lysed. שיטה זו יושמה בהצלחה שורות תאים אנושיים במבחנה, כמו גם מערכת ביולוגית מורכבת in vivo 7.
איור 2. ספציפיות של תיוג על פני קרום התא חלבון.
חלבונים cellsurface של CHO-K1 תאים תויגו עם Cy3 ו מופרדים. שברים שונים הופרדו על ידי אלקטרופורזה 2 D-וסרק עבור Cy3 פלואורסצנטי (A). הג'לים אותו אז היו מוכתמים כסף (B).
חלוקה
יש רק הבדלים קלים דפוס המקום למדגם קרום מופרדים לעומת המדגם nonfractionated (איור 2). שתי מפות נקודה הושוו באמצעות DeCyder 2-D ניתוח תוכנה דיפרנציאלי כל הנקודות זוהה שבר את הממברנה נכחו גם במדגם שאינם מופרדים. חלוקה, ולכן אין צורך לשפר זיהוי של חלבונים פני התא, אך ניתן להשתמש כדי לאמת את חוסר תיוג של חלבונים בתוך התאים.
השוואה בין פרוטוקולים
כדי להיות מסוגל להעריך את היתרונות עם הפרו תא השטח החדשטיין תיוג פרוטוקול, השוואה עם תקן Ettan DIGE פרוטוקול בוצעה. שני מדגמים זהים מ CHO-K1 תאים שגודלו בקבוק באותו תויגו במקביל עם שני פרוטוקולים שונים, בהתאמה (איור 1). על פני קרום התא Cy5 מדגם שכותרתו היתה לרוץ על ג'ל זהה lysate תא Cy3 שכותרתו. כתמים ירוקים (Cy3) על הג'ל (איור 3A) מייצגים את החלבונים שכותרתו באמצעות ההליך DIGE תקן Ettan ואחריו חלוקה הממברנה. כתמים אלה הם ככל הנראה חלבונים בממברנה כולל משטח חלבוני התא, כמו גם חלבונים מן ממברנות בתוך התא (ER, Golgi, mitochondrion, ואת הגרעין). תקן Ettan הליך DIGE תיוג ואחריו צעד חלוקה קרום נבחר לשם השוואה, מכיוון שהוא צריך לתת את ההסתברות הגבוהה ביותר לאיתור הנמוך בשפע פני חלבונים בתא. נקודות אדומות (סיי 5) על הג'ל (איור 3A) הם פני התא חלבונים ספציפיים שכותרתו באמצעות התא החדש משטח חלבון תיוג פרוטוקול שאינם גלויים עם תיוג ההליך הסטנדרטי (כתמים ירוקים). יתר על כן, כתמים צהובים מייצגים חלבונים החופפים המתרחשים הן דגימות או באמצעות הליך (איור 3A). יישום שימושי נוסף יהיה לשלב בין שתי פרוטוקולים תיוג להבחין חלבונים על פני התא מאלו על ממברנות תאיים. יתר על כן, מידע אודות שינויים יחסית משטח / קרום התא רמות החלבון לאחר גירויים שונים יכול להיות מלווה בשתי טכניקות תיוג בו זמנית.
איור 3.
(א) 2-D ג'ל תמונות של CHO-K1 Cy5 על פני קרום התא מדגם שכותרתו (כתמים אדומים, ראה פרוטוקול 1, איור 1) ואת קרום מופרדים Cy3 מדגם (כתמים ירוקים, ראה פרוטוקול 2, איור 1) שכותרתו פי תקן Ettan DIGE פרוטוקול לרוץ הג'ל 2-D זהה. (ב) DeCyder 2-D ניתוח דיפרנציאלי תוכנה דעות מן ג'ל 2-D מראה חלבון על פני קרום התא הנקרא אינו גלוי באמצעות תקן Ettan DIGE פרוטוקול.
זיהוי של חלבונים פני התא
מאז הדפוס במקום שונה מאוד בין משטח התא שכותרתו המדגם מדגם הכולל חלבון הנקרא, היה צורך לכלול שטח פני התא שכותרתו ספייק כדי לאפשר התאמה וזיהוי של תאים על פני נקודות במפה נקודה preparative. משטח כל החלבונים בתא נבחרו. משטח חלבוני התא יכול להיות קשה לזהות בגלל שפע הנמוכה שלהם. כמות חלבון בפועל במקומות מסוימים עשויים להיות מספיק לצורך זיהוי, שכן על פני התא חלבונים מועשרים חזותית ולא מועשר פיזית בפרוטוקול זה. כדי להקל על זיהוי מוצלח של חלבונים נמוך השטח שופע התא, הסכומים preparative של חלבון הכולל יכול להיות מועשר על חלבונים בממברנה לפני יישום על אלקטרופורזה 2-D. אלו תאים CHO, חלבונים בממברנה חלבונים תאיים משטח התא מהווים כ 20% חלבון מסך בתאים. עבור סוג זה התאים, כמות החלבון במקומות שעלולים להיות גדל פי 5 על ידי העשרה של חלבונים בממברנה. כמו כן, השימוש של ה-pH במרווחים צרים שיפוע של רצועות IPG יאפשר יישום של כמויות גדולות יותר של חלבון. במחקר זה השתמשנו רק 600 מיקרוגרם חלבון הכולל, עם העשרה לא עבור חלבונים בממברנה, ורצועה רחבה IPG טווח. אנחנו עדיין מסוגלים לזהות מספר רב של חלבונים פני התא, מתוכם 82% היו ידועים בעבר חלבונים בממברנה קשור.
רבוב
כדי לבדוק את שטח פני התא חלבון תיוג פרוטוקול בניסוי DIGE Ettan באמצעות כל שלושת צבעי 6, סדרה של דגימות נסיוב לתאים מדולדל CHO נאספו משטח חלבוני התא מסומן בנקודות זמן שונות (טבלה 1). דוגמאות הופרדו על ידי אלקטרופורזה 2-D. הכנת תקן פנימי עבור ניסוי שטח פני התא DIGE היא פשוטה. במקרה זה, סיי 2 שטח פני התא דגימות שכותרתו (מכל נקודות זמן) היו ונקווה ומשמש כסטנדרט פנימי להחיל ג'ל 2-D כל אחד. שטח פני התא כל שלושת CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי שכותרתו חלבונים דומה (מידע לא מוצג). שינויים בביטוי במהלך רעב בסרום עבור רבים של חלבונים בתא השטח התגלו באמצעות DeCyder 2-D תוכנה (איור 4).
איור 4.
שינוי הביטוי של שני על פני קרום התא חלבונים במהלך הרעבה של CHO-K1 תאים. מפות ספוט נותחו באמצעות DeCyder 2-D תוכנת ניתוח דיפרנציאלי.
מסקנות
פרוטוקול חדש Ettan DIGE תיוג פני התא חלבון מהירה, פשוטה use וספציפי מאוד עבור תיוג משטח חלבוני התא. הרומן חלבונים רבים בתא השטח הם לגילוי רק בעת השימוש על פני קרום התא תיוג פרוטוקול חלבון. במשך 80 חדשים על פני קרום התא חלבונים בתאי CHO התגלו באמצעות DeCyder 2-D ניתוח תוכנה דיפרנציאלי. מעל 80% משטח המקומות המזוהים תא שכותרתו היו קשורים חלבונים בממברנה.
ריבוב מושגת באמצעות שלוש CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלית, בשילוב עם DeCyder 2-D התוכנה, פרוטוקול חדש זה הוא כלי רב עוצמה ללימוד משטח חלבוני התא עם כל היתרונות שהושגו עם הטכנולוגיה DIGE 2-D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים פרופ Dontscho Kerjaschki, קורינה מיירהופר ו סיגורד קריגר במכון לפתולוגיה קלינית, אוניברסיטת וינה, אוסטריה על שיתוף הפעולה שלהם.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
