Summary
एक सरल और विशिष्ट विधि फ्लोरोसेंट लेबलिंग और fractionation कदम बिना कोशिका की सतह प्रोटीन का बढ़ाया पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया गया. कोशिका की सतह प्रोटीन में विभेदकों बहुतायत दो आयामी वैद्युतकणसंचलन (2 डी) और Ettan ™ DIGE प्रौद्योगिकी का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था.
Abstract
भूतल प्रोटीन सेल अपने पर्यावरण के लिए प्रतिक्रिया और पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की क्षमता के लिए केंद्रीय हैं. वे लगभग सभी intracellular संकेत के inducers हो जाना जाता है. इसके अलावा, वे पर्यावरण अनुकूलन और नशीली दवाओं के उपचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और अक्सर रोग के रोगजनन और विकृति (1) में शामिल हैं. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के संकेत दे रास्ते के लिए आंतरिक हैं, और इन जटिल जैविक प्रक्रियाओं में और अधिक जानकारी प्राप्त कोशिका की सतह प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए, संवेदनशील और विश्वसनीय तरीके की जरूरत है. दो आयामी वैद्युतकणसंचलन (2 डी) बड़े पैमाने पर बायोमार्कर और जटिल प्रोटीन के नमूने में अन्य लक्ष्यों का पता लगाने के अंतर परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए के लिए प्रयोग किया जाता है. सेल सतह प्रोटीन, आंशिक रूप से उनके कम बहुतायत (1 सेलुलर प्रोटीन के 2%) के कारण, fractionation या कुछ अन्य प्रकार के संवर्धन के बिना एक 2 - डी जेल में पता लगाने के लिए मुश्किल हैं. उन्होंने यह भी अक्सर खराब कर रहे हैं 2-D जैल उनके hydrophobic प्रकृति और उच्च आण्विक वजन (2) के कारण में प्रतिनिधित्व. इस अध्ययन में, हम बरकरार विशिष्ट और प्रोटीन के इस महत्वपूर्ण समूह की लेबलिंग का पता लगाने के लिए CyDye DIGE Fluor न्यूनतम रंगों का उपयोग कोशिकाओं के लिए एक नए प्रोटोकॉल उपस्थित थे. परिणाम intracellular प्रोटीन की न्यूनतम लेबलिंग के साथ एक कोशिका की सतह प्रोटीन की एक बड़ी संख्या में विशिष्ट लेबलिंग दिखाया. यह प्रोटोकॉल, तेजी से उपयोग करने के लिए सरल है, और सभी तीन CyDye DIGE Fluor न्यूनतम रंजक (2 Cy, 3 Cy और Cy 5) के लिए सेल सतह प्रोटीन लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन सुविधाओं Ettan DIGE और प्रोटीन अभिव्यक्ति 2 - डी DeCyder विभेदकों विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिवर्तन की प्रौद्योगिकी और विश्लेषण के साथ 2-D प्रतिदीप्ति अंतर जेल वैद्युतकणसंचलन (2 डी DIGE) का उपयोग कर बहुसंकेतन के लिए अनुमति देते हैं. सेल सतह प्रोटीन के स्तर के बाद समय के विभिन्न लंबाई के लिए चो कोशिकाओं (देखें तालिका 1) के सीरम भुखमरी के दौरान किया गया था. बहुतायत में छोटे परिवर्तन उच्च सटीकता के साथ पाया गया है, और परिणाम को परिभाषित सांख्यिकीय तरीकों द्वारा समर्थित किया गया है.
Protocol
सेल संस्कृति
- चीनी हैम्स्टर अंडाशय (चो-K1) कोशिकाओं F-12 हाम मध्यम में GlutaMAX मैं 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 50 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन, और 50 μg / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट (Invitrogen) युक्त के साथ मानक सेल संस्कृति प्रक्रियाओं का उपयोग कर आगे बढ़ें.
- सीरम स्वतंत्र मीडिया के लिए संस्कृति के माध्यम विनिमय. लेबल कोशिका की सतह प्रोटीन CyDye DIGE Cy3 Fluor या Cy5 न्यूनतम रंजक (अनुभाग सेल भूतल लेबल, नीचे देखें) के साथ अलग अलग समय बिंदुओं पर थे .
- पूल के हर बार बिंदु और CyDye DIGE Fluor Cy2 के साथ लेबल से कोशिकाओं के बराबर संख्या. प्रत्येक 2 - डी जेल के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में इन का प्रयोग करें.
- चो-K1 कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के बहुमत का प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन माउस भ्रूण (3T3 L1) fibroblasts और माउस जलोदर लिंफोमा lymphoblasts (EL4) भी (नहीं दिखाया डेटा) का प्रयोग कर सकते हैं.
- GlutaMAX द्वितीय के साथ दो DMEM मध्यम में उत्तरार्द्ध सेल प्रकार होते हैं, लेकिन, अन्यथा, चो-K1 कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया समान शर्तों का उपयोग करें.
कोशिका की सतह लेबलिंग
- ध्यान से पक्षपाती कोशिकाओं गैर enzymatically अलग, गिनती और 5-10 x106 कोशिकाओं की aliquots में विभाजित है. निलंबन में बढ़ कोशिकाओं के लिए, detaching कदम को छोड़.
- के बारे में 5 मिनट के लिए 800 XG में सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. मध्यम युक्त supernatants निकालें.
- 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड हांक संतुलित नमक (HBSS) समाधान 8.5 पीएच में resuspendion से छर्रों से धो लें. 4 में 800 XG ° सी 2 मिनट के लिए पर Centrifuged.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और 200 μl बर्फ ठंड लेबलिंग बफर में सेल गोली (HBSS पीएच 8.5, 1 एम यूरिया) resuspend.
- अंधेरे में बर्फ पर 20 मिनट के लिए 600 pmol CyDye DIGE Fluor न्यूनतम रंगों के साथ बरकरार कोशिकाओं लेबल.
- 20 μl 10 lysine मिमी जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाने. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- सतह लेबल कोशिकाओं में दो बार 500 μl HBSS 7.4 पीएच, 800 XG पर 4 पर centrifugation ° सी 2 मिनट के लिए द्वारा पीछा में resuspension द्वारा धो लें.
सेल lysis और fractionation
- 150 μl ठंड lysis बफर (7 एम यूरिया, 2 एम Thiourea, 4% chaps, 30 मिमी Tris, 5 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट 8.5 पीएच) में सतह कोशिकाओं लेबल lyse. सामयिक vortexing के साथ कम से कम 1 घंटे के लिए बर्फ पर छोड़ दें.
- 10 000 XG पर lysates 4 बजे ° 5 मिनट के लिए सी अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण. यह नमूना गैर fractionated सभी सेलुलर प्रोटीन युक्त नमूना है.
- समानांतर में, कक्ष छर्रों धोने, के रूप में ऊपर है, तो fractionate झिल्ली और साइटोसोलिक भिन्न पहले 2 - डी जेल वैद्युतकणसंचलन में (एक झिल्ली fractionation किट का उपयोग कर, पियर्स). झिल्ली अंश आंतरिक और कोशिका की सतह झिल्ली प्रोटीन होते हैं.
- तुलना के लिए, मानक Ettan DIGE 3 प्रक्रिया का पालन करें, और lyse, लेबल, और, अंत में, कोशिकाओं fractionate. डी क्वांट किट (जीई हेल्थकेयर) - 2 का उपयोग नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
2 - डी वैद्युतकणसंचलन
- Immobiline DryStrip जैल, 3 11NL पीएच (24 सेमी) Immobiline DryStrip Reswelling ट्रे, 450 μl DeStreak पुनर्जलपूरण समाधान में 24 सेमी (0.5% IPG बफर) रातोंरात का उपयोग rehydrate.
- CyDye लेबल नमूने (50 μg कुल प्रोटीन इसी) को लागू करने के लिए कई गुना में anodic कप लोड करके DryStrip जैल Immobiline और isoelectric (IEF) ध्यान केंद्रित के निर्देशों के अनुसार Ettan IPGphor द्वितीय IEF सिस्टम का उपयोग कर प्रदर्शन.
- IEF के बाद, बड़े (26 x 20 सेमी) 12.5% polyacrylamide जैल (एसडीएस पृष्ठ) के शीर्ष पर दो कदम और जगह में स्ट्रिप्स संतुलित. 0.5% agarose के साथ ओवरले (bromophenol नीले युक्त बफर चलाने में). 2-D 5 डब्ल्यू / 30 मिनट के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन भागो Ettan DALTtwelve बड़े कार्यक्षेत्र सिस्टम का उपयोग कर, और फिर 15 में डब्ल्यू / डाई सामने जब तक जेल जेल के नीचे तक पहुँचता है.
इमेजिंग और डेटा विश्लेषण
- 2 - डी वैद्युतकणसंचलन पूरा करने के बाद, Cy3 Cy2, या Cy5 के लिए जैल स्कैन एक आंधी 9410 परिवर्तनीय मोड Imager का उपयोग.
- झिल्ली भिन्न, साइटोसोलिक भिन्न है, और गैर - fractionated नमूने 2 - डी DeCyder विभेदकों विश्लेषण 4 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर से हाजिर नक्शे की तुलना करें.
बाद धुंधला हो जाना
- इमेजिंग के बाद, चांदी मानक प्रक्रिया के करने के लिए 5 अनुसार जैल दाग .
प्रोटीन की पहचान
- आगे बढ़ें, फसल धोने, और प्रारंभिक (लगभग 1 मिलीग्राम 10 x106 चो कोशिकाओं से कुल प्रोटीन) मात्रा में कोशिकाओं के, के रूप में एक गैर fractionated नमूना के लिए ऊपर वर्णित lyse. एक कील के रूप में Cy5 कोशिका की सतह लेबल नमूना (ऊपर देखें) का प्रयोग करें, और प्रोटीन की unlabelled प्रारंभिक मात्रा के साथ एक साथ लागू होते हैं.
- ऊपर वर्णित के रूप में 2 - डी वैद्युतकणसंचलन कैर्री, लेकिन इस समय, aplly 600 μg unlabeled सेल 50 μg सेल anodic कप आवेदन द्वारा स्पाइक लेबल सतह के साथ मिलकर lysate. संदर्भ मार्कर का उपयोग करने के लिए सही मौके उठा की अनुमति है, और जगह पर होनाके बीच जेल कास्टिंग पहले 3 सिफारिशों के अनुसार गिलास प्लेट.
- Cy5 कोशिका की सतह हाजिर नक्शे, कुल प्रोटीन का उपयोग डीप बैंगनी कुल प्रोटीन 3 दाग धुंधला द्वारा पीछा प्राप्त Cy5 चैनल में जेल स्कैन.
- एक साथ दो मौके DeCyder का उपयोग कर नक्शे 2 - डी सॉफ्टवेयर मिलान और सभी Cy 5 लेबल कोशिका की सतह प्रोटीन के लिए इसी स्थानों के लिए एक पिकअप सूची बनाने. कोशिका की सतह प्रोटीन का उपयोग Ettan मौके से निपटने स्टेशन उठाओ, जेल प्लग से निकालने के लिए, और Ettan पाचक का उपयोग trypsinate करें. MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग को पहचानें.
टेबल 1 एक Ettan DIGE प्रयोग सीरम समाप्त संख्या 1 में सेल सतह प्रोटीन लेबलिंग प्रोटोकॉल के अनुसार लेबल कोशिकाओं से नमूने का उपयोग किया गया था.
| नमूना | सीरम रिक्तीकरण के समय | CyDye के साथ लेबल | जेल संख्या |
| 1 | - | 3 Cy, 2 Cy | 1 |
| 2 | 30 मिनट | Cy 5, 2 Cy | 1 |
| 3 | 2 घंटे | 3 Cy, 2 Cy | 2 |
| 4 | 4 घंटे | Cy 5, 2 Cy | 2 |
| 5 | 16 घंटे | Cy 5, 2 Cy | 3 |
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Discussion
प्रोटीन एकाग्रता
दो लेबलिंग workflows की एक सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है. चूंकि कोशिकाओं को अभी भी बरकरार हैं जब सेल सतह प्रोटीन लेबलिंग प्रोटोकॉल के अनुसार लेबल, केवल कोशिका की सतह प्रोटीन डाई करने के लिए उजागर कर रहे हैं. मानक Ettan DIGE प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं से पहले और लेबलिंग प्रोटीन (चित्र 1) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंदर बाहर सेल में चिह्नित कर रहे हैं lysed हैं. डाई के सापेक्ष सेल सतह प्रोटीन लेबलिंग प्रोटोकॉल में प्रोटीन के लिए राशि में जाना जाता है, नहीं के बाद से सेल सतह प्रोटीन विशेष रूप से quantitated नहीं किया जा सकता है. हालांकि, यह ज्ञात है कि कोशिका की सतह प्रोटीन सेलुलर 2 प्रोटीन की एक बहुत ही कम अनुपात का गठन. लगभग 5-10 x10 डाई की 600 pmol 6 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया . यह संभव हो कम कोशिकाओं का उपयोग करने के बाद से ही इस अध्ययन में nonfractionated नमूना के 12.5-25% 2 - डी वैद्युतकणसंचलन के लिए इस्तेमाल किया गया था हो सकता है.
1 अंजीर. वर्कफ़्लो प्रोटोकॉल लेबलिंग का ओवरव्यू
विभिन्न भागों में प्रोटीन सांद्रता 2 - डी क्वांट किट का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. कुल प्रोटीन 10 x10 चो 6-K1 कोशिकाओं से व्युत्पन्न राशि गैर fractionated नमूना में 920 μg, साइटोसोलिक / हाइड्रोफिलिक अंश में μg / झिल्ली हाइड्रोफोबिक अंश और 770 में 225 μg था. इन राशियों के सबसे अधिक संभावना सेल प्रकार और सेल आकार पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. प्रोटीन है कि सेल की सतह प्रोटोकॉल में चिह्नित कर रहे हैं के अनुपात मानक Ettan DIGE न्यूनतम लेबलिंग, जो कुल प्रोटीन की 2-3% की तुलना में अधिक हो सकता है. ऐसा लगता है कि केवल एक डाई अणु प्रोटीन अणु प्रति संलग्न है, के बाद से हाजिर आकार जैल पर कम आणविक प्रोटीन का दौर और ऊर्ध्वाधर streaking है अनुपस्थित है (चित्र 2 और 3). प्रोटीन प्रति दो और अधिक डाई अणु अनुलंब लेबल प्रोटीन की वृद्धि हुई आणविक भार के कारण streaking कारण होता है. इस घटना ज्यादातर कम आणविक भार प्रोटीन के साथ देखा होगा, क्योंकि इन प्रोटीनों की आणविक वजन में परिवर्तन एक बड़ा जेल पर उच्च आण्विक भार प्रोटीन की तुलना में बदलाव पर नतीजा होगा.
सेल सतह प्रोटीन विशिष्ट लेबलिंग
कोशिकाओं के दो नमूने समान थे CyDye DIGE Fluor Cy3 सतह के साथ लेबल. एक lysed और 2 - डी वैद्युतकणसंचलन के लिए सीधे इस्तेमाल किया था. अन्य नमूना lysed और झिल्ली और साइटोसोलिक भिन्न में fractionated था. पूरे फ्लोरोसेंट लेबल झिल्ली अंश में दिखाई दिया, साइटोसोलिक अंश किसी भी प्रोटीन लेबल (चित्र 2) से रहित था. साइटोसोलिक प्रोटीन के नमूने के साथ एक ही जेल चांदी दाग था और परिणाम से पता चला है कि वहाँ जेल में प्रोटीन थे, लेकिन वे सेल सतह प्रोटीन लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग नहीं लेबल थे. इन परिणामों का सुझाव है कि इस नए लेबलिंग प्रोटोकॉल कोशिका की सतह प्रोटीन के लिए विशिष्ट है. CyDye DIGE Fluor न्यूनतम डाई सेल या कोशिका झिल्ली के माध्यम से गुजारें दर्ज करें प्रकट नहीं होता. कोशिकाओं को बर्फ पर लेबलिंग पहले रखा जाता है और यह झिल्ली भर में किसी भी परिवहन को कम कर सकते हैं. CyDye DIGE Fluor न्यूनतम डाई जोखिम के लिए समय भी अपेक्षाकृत कम है (20 मिनट) है, जो प्रोटीन लेबलिंग के लिए नहीं बल्कि कक्ष में प्रवेश के लिए पर्याप्त है. सेल के अंदर लेबलिंग की कमी के लिए एक अन्य संभावित व्याख्या यह है कि अगर डाई झिल्ली भर गुजरता है, तो सेल के अंदर पीएच एक कुशल लेबलिंग होते रिएक्शन (इष्टतम पीएच 8.5) के लिए भी कम (<7.4 पीएच) है. लेबलिंग प्रतिक्रिया बुझती है कोशिकाओं है, जो आगे किसी भी प्रोटीन लेबलिंग रोकता के बाद कोशिकाओं lysed किया गया है धोने के बाद. इस पद्धति का सफलतापूर्वक इन विट्रो में मानव कोशिका लाइनों के रूप में अच्छी तरह के रूप में 7 vivo में एक जटिल जैविक प्रणाली को लागू किया गया है.
2 अंजीर. सेल सतह प्रोटीन लेबलिंग की विशिष्टता.
चो - K1 कोशिकाओं के cellsurface प्रोटीन के साथ लेबल Cy3 और fractionated थे. 2 - डी वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग भिन्न अलग हो गए थे और Cy3 प्रतिदीप्ति के लिए स्कैन (ए). वही जैल तो चांदी दाग (बी) थे.
Fractionation
वहाँ केवल झिल्ली fractionated नमूना के लिए हाजिर पैटर्न में मामूली nonfractionated नमूना (चित्र 2) के साथ तुलना में मतभेद हैं. दो स्पॉट नक्शे 2 - डी DeCyder विभेदकों विश्लेषण सॉफ्टवेयर और सभी झिल्ली अंश में पता चला स्पॉट का प्रयोग भी गैर fractionated नमूना में उपस्थित थे की तुलना में थे. Fractionation, इसलिए, कोशिका की सतह प्रोटीन का पता लगाने में सुधार के लिए आवश्यक है, लेकिन नहीं है कोशिकाओं के अंदर प्रोटीन की लेबलिंग की कमी की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रोटोकॉल के बीच तुलना
नई कोशिका की सतह समर्थक के साथ लाभ का मूल्यांकन करने में सक्षम हो करने के लिएtein लेबलिंग प्रोटोकॉल, मानक Ettan DIGE प्रोटोकॉल के साथ तुलना किया गया था. चो K1 ही कुप्पी में विकसित कोशिकाओं से दो नमूने समान दो अलग अलग प्रोटोकॉल, क्रमशः (चित्र 1) के साथ समानांतर में लेबल किया गया. एक सेल सतह Cy5 लेबल नमूना एक ही जेल पर एक Cy3 लेबल सेल lysate के रूप में चलाया गया था. जेल पर हरे धब्बे (Cy3) (चित्र 3A) मानक Ettan DIGE झिल्ली fractionation द्वारा अपनाई गई प्रक्रिया का उपयोग लेबल प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं. ये धब्बे संभाव्यतः झिल्ली प्रोटीन कोशिका की सतह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन कोशिका के अंदर झिल्ली (ईआर Golgi, mitochondrion, और नाभिक) से प्रोटीन सहित. मानक Ettan DIGE लेबलिंग एक झिल्ली fractionation कदम द्वारा अपनाई गई प्रक्रिया तुलना के लिए चुना गया था, क्योंकि यह कम प्रचुर मात्रा में कोशिका की सतह प्रोटीन का पता लगाने के लिए सबसे अधिक संभावना देना चाहिए. जेल (चित्र 3A) पर लाल धब्बे (5 Cy) कोशिका की सतह विशिष्ट नई कोशिका की सतह प्रोटीन लेबलिंग प्रोटोकॉल है कि मानक लेबलिंग प्रक्रिया (हरी धब्बों) के साथ दिखाई नहीं कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए लेबल प्रोटीन. इसके अलावा, पीले धब्बे अतिव्यापी प्रोटीन है कि दोनों या तो प्रक्रिया (चित्र 3A) का उपयोग के नमूनों में पाए जाते हैं प्रतिनिधित्व करते हैं. एक और उपयोगी अनुप्रयोग के लिए दोनों लेबलिंग intracellular झिल्ली पर उन लोगों से कोशिका की सतह पर प्रोटीन भेद प्रोटोकॉल गठबंधन होगा. इसके अलावा, विभिन्न उत्तेजनाओं के बाद सेल / सतह झिल्ली प्रोटीन के स्तर में रिश्तेदार परिवर्तन के बारे में में जानकारी एक साथ दोनों लेबलिंग तकनीक का उपयोग करके पीछा किया जा सकता है.
3 अंजीर.
(ए) 2 - डी की जेल छवियों चो-K1 Cy5 सेल सतह नमूना लेबल (लाल धब्बे, 1 प्रोटोकॉल, चित्र 1 देखें) और एक झिल्ली fractionated Cy3 नमूना (हरी स्पॉट, 2 प्रोटोकॉल, एक छवि देखें) के अनुसार लेबल मानक Ettan DIGE प्रोटोकॉल एक ही जेल 2 - डी में चलाते हैं. (बी) DeCyder 2 डी 2 डी जेल से एक सेल सतह लेबल नहीं दिखाई प्रोटीन मानक Ettan DIGE प्रोटोकॉल का उपयोग कर दिखा विभेदकों विश्लेषण सॉफ्टवेयर देखा गया.
कोशिका की सतह प्रोटीन की पहचान
चूंकि हाजिर पैटर्न एक सेल लेबल सतह नमूना और कुल प्रोटीन नमूना लेबल के बीच बहुत अलग है, यह एक सेल सतह स्पाइक मिलान की पहचान और प्रारंभिक हाजिर नक्शे में कोशिका की सतह स्पॉट सक्षम करने के लिए लेबल शामिल करने के लिए आवश्यक था. सभी कोशिका की सतह प्रोटीन उठाया गया था. सेल सतह प्रोटीन उनके कम बहुतायत के कारण पहचान मुश्किल हो सकता है. कुछ स्थानों में वास्तविक प्रोटीन राशि की पहचान के लिए अपर्याप्त हो, के बाद से कोशिका की सतह प्रोटीन नेत्रहीन समृद्ध कर रहे हैं और इस प्रोटोकॉल का उपयोग शारीरिक नहीं समृद्ध हो सकता है. कम प्रचुर मात्रा में कोशिका की सतह प्रोटीन का सफल पहचान की सुविधा के लिए, प्रारंभिक कुल प्रोटीन की मात्रा झिल्ली प्रोटीन के लिए आवेदन करने से पहले किया जा सकता है 2-D वैद्युतकणसंचलन पर समृद्ध है. इन चो कोशिकाओं में intracellular झिल्ली प्रोटीन और कोशिका की सतह प्रोटीन कोशिकाओं में कुल प्रोटीन का लगभग 20% का गठन. इस कोशिका प्रकार के लिए, स्पॉट में प्रोटीन राशि संभावित झिल्ली प्रोटीन के संवर्धन के द्वारा एक कारक द्वारा 5 सकता है वृद्धि की जानी है. इसके अलावा, IPG स्ट्रिप्स संकीर्ण ढाल पीएच अंतराल का उपयोग प्रोटीन की बड़ी मात्रा के आवेदन की अनुमति देगा. इस अध्ययन में हम झिल्ली प्रोटीन के लिए कोई संवर्धन, और एक व्यापक रेंज IPG पट्टी के साथ केवल 600 μg कुल प्रोटीन, इस्तेमाल किया. हम अभी भी कोशिका की सतह प्रोटीन की एक बड़ी संख्या है, जिनमें से 82% पहले झिल्ली जुड़े प्रोटीन के रूप में जाने जाते थे की पहचान करने में सक्षम थे.
बहुसंकेतन
एक Ettan DIGE सभी तीन 6 रंजक, सीरम समाप्त चो कोशिकाओं से नमूने एकत्र थे और अलग अलग समय अंक (1 टेबल) में कोशिका की सतह प्रोटीन लेबल की एक श्रृंखला का उपयोग करके प्रयोग में सेल सतह प्रोटीन लेबलिंग प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए. नमूने 2-D वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया गया. एक कोशिका की सतह DIGE प्रयोग के लिए एक आंतरिक मानक की तैयारी सरल है. इस मामले में, Cy 2 कोशिका की सतह लेबल नमूने (सभी समय अंक से) जमा थे और एक आंतरिक मानक के रूप में प्रत्येक 2 - डी जेल के लिए लागू किया जाता है. सभी तीन CyDye DIGE Fluor न्यूनतम रंजक लेबल कोशिका की सतह इसी तरह प्रोटीन (नहीं दिखाया डेटा). कोशिका की सतह प्रोटीन के कई के लिए सीरम भुखमरी के दौरान अभिव्यक्ति में परिवर्तन DeCyder 2 - डी सॉफ्टवेयर (चित्र 4) का उपयोग पाया गया.
4 अंजीर.
चो - K1 कोशिकाओं के भुखमरी के दौरान दो सेल सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति में बदलें. स्पॉट नक्शे 2 - डी DeCyder विभेदकों विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया.
निष्कर्ष
कोशिका की सतह प्रोटीन लेबलिंग के लिए नए Ettan DIGE प्रोटोकॉल तेजी से, वे हमें करने के लिए सरल हैसे और कोशिका की सतह प्रोटीन लेबलिंग के लिए अत्यधिक विशिष्ट है. कई उपन्यास कोशिका की सतह प्रोटीन केवल detectable हैं जब सेल सतह प्रोटीन लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग. चो कोशिकाओं के लिए 80 से अधिक नए सेल सतह प्रोटीन 2 - डी DeCyder विभेदकों विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग पाया गया. पहचान की कोशिका की सतह लेबल स्पॉट का 80% से अधिक झिल्ली प्रोटीन जुड़े थे.
बहुसंकेतन तीन CyDye DIGE Fluor न्यूनतम रंगों का उपयोग करने के लिए हासिल की है, और संयोजन में DeCyder के साथ 2 - डी सॉफ्टवेयर, इस नए प्रोटोकॉल 2-D DIGE तकनीक के साथ प्राप्त सभी लाभ के साथ कोशिका की सतह प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है.
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Acknowledgments
हम उनके सहयोग के लिए क्लीनिकल पैथोलॉजी, ऑस्ट्रिया, वियना विश्वविद्यालय के संस्थान में प्रोफेसर Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer और Sigurd क्रीगर धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
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- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
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- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
