Summary
Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.
Abstract
Proteínas de superficie son esenciales para la capacidad de las células para reaccionar a su entorno e interactuar con las células vecinas. Son conocidos por ser inductores de casi toda la señalización intracelular. Además, juegan un papel importante en la adaptación del medio ambiente y tratamiento de drogas, y están a menudo involucrados en la patogénesis de la enfermedad y la patología (1). Interacciones proteína-proteína son intrínsecos a las vías de señalización, y para obtener mayor conocimiento en estos procesos biológicos complejos, los métodos sensibles y fiables son necesarios para el estudio de las proteínas de la superficie celular. De dos dimensiones (2-D) de electroforesis es ampliamente utilizado para la detección de biomarcadores y otras metas, en las muestras de proteínas complejas para estudiar los cambios diferenciales. Proteínas de superficie celular, en parte debido a su baja abundancia (un 2% de las proteínas celulares), son difíciles de detectar en un gel 2-D sin fraccionamiento o algún otro tipo de enriquecimiento. También están a menudo mal representados en geles 2-D, debido a su naturaleza hidrofóbica y de alto peso molecular (2). En este estudio, se presenta un nuevo protocolo para las células intactas utilizando CyDye DIGE tintes Fluor mínimos para el etiquetado específico y la detección de este importante grupo de proteínas. Los resultados mostraron un etiquetado específico para un gran número de proteínas de superficie celular con un mínimo de etiquetado de las proteínas intracelulares. Este protocolo es rápido, fácil de usar, y los tres CyDye DIGE tintes Fluor mínima (Cy 2, 3 y Cy Cy 5) puede ser utilizada para etiquetar las proteínas de la superficie celular. Estas funciones permiten la multiplexación mediante la electroforesis en 2-D de fluorescencia Gel Diferencia (2-D DIGE) con Ettan tecnología DIGE y el análisis de los cambios de expresión de la proteína usando DeCyder 2-D software de análisis diferencial. El nivel de las proteínas de la superficie celular se siguió durante la privación de suero de las células CHO durante distintos períodos de tiempo (ver Tabla 1). Los pequeños cambios en la abundancia se detectaron con gran precisión, y los resultados se definen con el apoyo de métodos estadísticos.
Protocol
De cultivo celular
- Crecer las células de ovario de hámster chino (CHO-K1), utilizando los procedimientos estándar de cultivo celular en medio Ham F-12 con glutamax que contiene 10% de suero fetal bovino, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen).
- Cambio del medio de cultivo a medio libre de suero. Etiqueta de proteínas de la superficie de la célula fueron en diferentes momentos con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 tintes mínima (ver sección de etiquetado de superficie celular, a continuación).
- Piscina igual número de células a partir de cada punto del tiempo y la etiqueta con CyDye DIGE Fluor Cy2. Use esto como un estándar interno para cada gel 2-D.
- La mayoría de los experimentos pueden realizarse con células CHO-K1, pero los fibroblastos de embrión de ratón (3T3 L1) y la ascitis del ratón linfoblastos linfoma (EL4) también se puede utilizar (datos no mostrados).
- Crecen los dos tipos de células en este último medio DMEM con glutamax II, pero, de lo contrario, utilice las mismas condiciones utilizadas para las células CHO-K1.
Células etiquetado superficie
- Con cuidado, separar las células adherentes no enzimática, a contar y dividir en partes alícuotas de 5.10 x106 células. De las células que crecen en suspensión, omita el paso separando.
- Se centrifuga la suspensión celular a unos 800 xg durante 5 minutos. Quitar el sobrenadante que contiene el medio.
- Lavar los pellets por resuspendion en solución salina equilibrada 1 ml de hielo frío de Hank (HBSS) pH 8,5. Centrifugaron a 800 xg a 4 ° C durante 2 minutos.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 200 buffer etiquetado helada l (HBSS pH 8,5, 1 M urea).
- Identificar a las células intactas con 600 pmol tintes CyDye DIGE Fluor mínimo durante 20 minutos sobre el hielo en la oscuridad.
- Detener la reacción añadiendo 20 l 10 mM lisina. Incubar durante 10 minutos.
- Lave la superficie marcada con células dos veces por resuspensión en 500 l HBSS pH 7,4, seguido por centrifugación a 800 xg a 4 ° C durante 2 minutos.
Lisis celular y fraccionamiento
- Lisis de la superficie de células marcadas en 150 l buffer de lisis frío (7 M urea, 2 M tiourea, CHAPS 4%, 30 mM Tris, 5 mM de magnesio acetato de pH 8,5). Dejar en hielo durante al menos 1 h con agitación ocasional.
- Centrifugar los lisados a 10 000 xg a 4 ° C durante 5 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Esta muestra es la muestra no fraccionada que contiene todas las proteínas celulares.
- Al mismo tiempo, lavar los sedimentos celulares, de arriba, luego fraccionar (con un kit de fraccionamiento de la membrana, Pierce) en la membrana y las fracciones citosólica antes del 2-D electroforesis en gel. La fracción de membrana contiene proteínas de la superficie interna y la membrana celular.
- Para la comparación, siguen el estándar Ettan procedimiento DIGE 3, y lisis, la etiqueta y, por último, fraccionar las células. Determinar la concentración de proteínas en las muestras usando el 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).
La 2-D
- Rehidratar geles Immobiline DryStrip, pH 3-11NL (24 cm) con bandeja DryStrip Immobiline Reswelling, 24 cm en 450 l solución de rehidratación DeStreak (0,5% IPG Buffer) durante la noche.
- Aplicar el CyDye marcado muestras (correspondiente a la proteína 50 mg en total) para Immobiline geles DryStrip por la carga de la taza anódica en el colector y realizar el isoelectroenfoque (IEF) con Ettan IPGphor II Sistema de IEF de acuerdo a las instrucciones.
- Después de IEF, se equilibran las tiras en dos pasos y el lugar en la parte superior de las grandes (26 x 20 cm) geles de poliacrilamida al 12,5% (SDS-PAGE). Superposición con el 0,5% de agarosa (en el funcionamiento de un tampón que contiene azul de bromofenol). Ejecutar 2-D utilizando Ettan DALTtwelve vertical de Grandes Sistemas de 5 W / gel durante 30 minutos, y luego a los 15 W / gel hasta que el frente tinte llega a la parte inferior del gel.
De imágenes y análisis de datos
- Después de completar 2-D electroforesis, los geles para la exploración Cy2, Cy3 o Cy5 mediante un tifón 9410 Imager modo variable.
- Comparar mapas de puntos a partir de fracciones de membrana, las fracciones citosólica, y las muestras no fraccionada con DeCyder 2-D software de análisis diferencial 4.
Después de la tinción
- Después de la filmación, la tinción de plata de los geles según el procedimiento estándar de 5.
La identificación de proteínas
- Cultivo, la cosecha, lavado y lisis de las cantidades de preparación (aproximadamente 1 mg de proteína total de 10 x106 células CHO) de las células, como se describe más arriba para una muestra no fraccionada. Utilice una muestra de células Cy5 superficie de la etiqueta (ver arriba) como un pico, y aplicar junto con la cantidad de preparación sin etiqueta de proteínas.
- Llevar a cabo la electroforesis en 2-D como se describió anteriormente, pero esta vez, aplly 600 mg de células sin etiqueta lisado junto con 50 mg de la superficie celular marcado pico anódico por la aplicación de taza. Use marcas de referencia para permitir recoger lugar correcto, y el lugar seentre las placas de vidrio antes de emitir gel de acuerdo con las recomendaciones 3.
- Escanear el gel en Cy5 canal para obtener la superficie de la célula Cy5 mapa de puntos, seguido por la tinción de proteínas totales utilizando la proteína total de profundo color púrpura mancha 3.
- Partido junto a los dos mapas de puntos con el DeCyder 2-D de software y crear una lista de selección para todos los puntos correspondientes a la Cy 5 etiquetados proteínas de superficie celular. Elija las proteínas de la superficie celular con el lugar Ettan estación de manipulación, extracto de los tapones de gel, y trypsinate con el digestor Ettan. Identificar mediante MALDI-TOF espectrometría de masas.
Tabla 1. Un experimento Ettan DIGE se realizó con muestras de suero de las células agotadas etiquetados de acuerdo con el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado en la figura 1.
| Muestra | Momento de agotamiento de suero | Etiquetado por CyDye | Gel número |
| 1 | - | Cy 3, Cy 2 | 1 |
| 2 | 30 minutos | Cy 5, Cy 2 | 1 |
| 3 | 2 horas | Cy 3, Cy 2 | 2 |
| 4 | 4 horas | Cy 5, Cy 2 | 2 |
| 5 | 16 horas | Cy 5, Cy 2 | 3 |
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Discussion
Concentración de proteínas
Una visión general de los dos flujos de trabajo de etiquetado se muestra en la Figura 1. Dado que las células están intactas cuando una etiqueta según el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado, sólo las proteínas de superficie de las células son expuestas a la tintura. En el protocolo estándar Ettan DIGE, las células se lisan antes de su etiquetado y las proteínas dentro como fuera de la célula están etiquetados (Fig. 1). La cantidad relativa de colorante a la proteína en el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado no se conoce, ya que la superficie celular de las proteínas no pueden ser cuantificados específicamente. Sin embargo, se sabe que las proteínas de la superficie celular constituyen una proporción muy baja de las proteínas celulares 2. Aproximadamente el 10.5 x 10 6 células a 600 pmol de tinte se utiliza. Puede ser posible el uso de menor cantidad de células, ya que sólo 12.5 a 25% de la muestra nonfractionated en este estudio se utilizó para la electroforesis en 2-D.
Fig. 1. Descripción general de etiquetado protocolos de flujo de trabajo
Las concentraciones de proteínas en las diferentes fracciones se determinaron utilizando el kit de 2-D Quant. La cantidad total de proteínas derivadas de 10 x 10 6 células CHO-K1 fue mg 920 en la muestra no fraccionada, 225 mg en la membrana mg / fracción hidrofóbica y 770 en la fracción citosólica / hidrofílicas. Estas cantidades más probable es que varían según el tipo de célula y tamaño de la celda. La proporción de proteínas que tienen la etiqueta en el protocolo de la superficie celular puede ser mayor que la norma de etiquetado Ettan DIGE mínima, que es 2.3% de proteína total. Parece que sólo una molécula de colorante se une por molécula de proteína, ya que la forma del punto es rayado ronda y vertical de las proteínas de bajo peso molecular en los geles está ausente (Fig. 2 y 3). Dos o más moléculas de colorante por la proteína que causa rayas verticales debido a aumento de peso molecular de la proteína marcada. Este fenómeno se vería en su mayoría con las proteínas de bajo peso molecular, ya que un cambio en el peso molecular de estas proteínas podría resultar en un cambio mayor en el gel en comparación con proteínas de alto peso molecular.
De la superficie celular de proteínas específicas de etiquetado
Dos muestras idénticas de las células de la superficie fueron etiquetados con CyDye DIGE Fluor Cy3. Uno fue sometido a lisis y se utiliza directamente para 2-D. La otra muestra fue sometido a lisis y se fracciona en la membrana y las fracciones citosólica. La etiqueta fluorescente completa apareció en la fracción de membrana, la fracción citosólica carecía de proteínas marcadas (Fig. 2). El mismo gel, con la muestra de proteína citosólica se tiñó de plata y el resultado mostró que había proteínas en el gel, pero no fueron etiquetados utilizando el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado. Estos resultados sugieren que este protocolo nuevo etiquetado es específica para las proteínas de la superficie celular. El CyDye DIGE tinte Fluor mínimo no parece entrar en la célula, o pasar a través de la membrana celular. Las células se mantienen en hielo antes de que el etiquetado y esto puede reducir el transporte a través de la membrana. El tiempo de exposición CyDye DIGE tinte Fluor mínima también es relativamente corto (20 minutos), lo cual es suficiente para el etiquetado de proteínas, pero no para entrar en la célula. Otra posible explicación para la falta de etiquetado dentro de la célula es que incluso si el medio de contraste pasa a través de la membrana, el pH dentro de la célula es muy bajo (pH <7,4) durante una reacción de marcaje eficaz que se produzca (pH óptimo de 8,5). La reacción de marcaje se apaga seguido por el lavado de las células, que además impide que el etiquetado de proteínas después de que las células se han lisado. Este método ha sido aplicado con éxito en células humanas in vitro, así como a un complejo sistema biológico en vivo 7.
Fig. 2. Especificidad de etiquetado proteínas de la superficie celular.
Las proteínas cellsurface de CHO-K1 células fueron marcadas con Cy3 y fraccionado. Las diferentes fracciones fueron separados por electroforesis en 2-D y escaneado para Cy3 fluorescencia (A). Los geles fueron luego misma tinción de plata (B).
Fraccionamiento
Sólo hay pequeñas diferencias en el patrón de punto para la muestra de la membrana fraccionada en comparación con la muestra nonfractionated (Fig. 2). Los dos mapas de puntos se compararon mediante DeCyder 2-D diferencial Software de Análisis y todos los puntos detectados en la fracción de membrana también estuvieron presentes en la muestra no fraccionada. Fraccionamiento, por lo tanto, no es necesario para mejorar la detección de proteínas de superficie celular, pero se puede utilizar para verificar la falta de etiquetado de las proteínas dentro de las células.
Comparación entre protocolos
Para poder evaluar las ventajas con el nuevo pro de la superficie celularproteína de etiquetado protocolo, una comparación con el protocolo estándar Ettan DIGE se llevó a cabo. Dos muestras idénticas a partir de células CHO-K1 crecido en el mismo recipiente se marcaron en paralelo con los dos protocolos diferentes, respectivamente (Fig. 1). Una célula de la superficie de la muestra Cy5 marcado se ejecutan en el mismo gel, como un lisado celular Cy3 etiquetados. Las manchas verdes (Cy3) en el gel (Fig. 3A) representan las proteínas marcadas con el procedimiento estándar de Ettan DIGE seguida por fraccionamiento de la membrana. Estas manchas son probablemente las proteínas de membrana como proteínas de superficie celular, así como las proteínas de las membranas dentro de la célula (ER, Golgi, mitocondrias y núcleo). Estándar Ettan procedimiento de etiquetado DIGE seguida de una etapa de fraccionamiento membrana fue elegido para la comparación, ya que se debe dar la más alta probabilidad de detectar la baja abundantes proteínas de la superficie celular. Las manchas rojas (Cy 5) en el gel (Fig. 3A) son proteínas de superficie celular específicos etiquetados con la nueva superficie celular de proteínas protocolo de etiquetado que no son visibles con el procedimiento de la norma de etiquetado (puntos verdes). Además, los puntos amarillos representan las proteínas superpuestas que se producen en ambas muestras mediante el procedimiento (Fig. 3A). Otra aplicación útil sería la de combinar los dos protocolos de etiquetado que permita distinguir las proteínas en la superficie celular de las de las membranas intracelulares. Por otra parte, la información sobre los cambios relativos en los niveles de proteína de la superficie celular / membrana después de varios estímulos se podría seguir utilizando tanto técnicas de etiquetado de forma simultánea.
Fig. 3.
(A) 2-D imágenes de gel de CHO-K1 Cy5 células de la superficie de la muestra marcada (manchas rojas, ver protocolo 1, Fig. 1) y una membrana fraccionada Cy3 muestra (puntos verdes, véase el protocolo 2, Fig. 1) etiquetados de acuerdo a estándar Ettan DIGE protocolo ejecutan en el mismo gel 2-D. (B) DeCyder 2-D diferencial vistas software de análisis del gel 2-D que muestra una proteína de la superficie celular etiqueta no es visible usando el estándar Ettan DIGE protocolo.
Identificación de las proteínas de la superficie celular
Dado que el patrón de punto es muy diferente entre una muestra de la etiqueta de la superficie celular y una muestra de proteína total de la etiqueta, que era necesario incluir una superficie de la célula marcada alza para permitir a juego y la identificación de los puntos de la superficie celular en el mapa de localizaciones de preparación. Todas las proteínas de la superficie celular fueron recogidos. Proteínas de superficie celular puede ser difícil de identificar debido a su baja abundancia. La cantidad real de proteína en algunos puntos pueden ser suficientes para la identificación, ya que las proteínas de la superficie celular son visualmente enriquecido y no físicamente enriquecido con este protocolo. Para facilitar la identificación exitosa de baja abundantes proteínas de la superficie celular, la cantidad de preparación de la proteína total puede ser enriquecido para las proteínas de membrana antes de su aplicación en 2-D. En estas células CHO, proteínas intracelulares de membrana y proteínas de superficie celular constituyen aproximadamente el 20% del total de proteínas en las células. Para este tipo de células, la cantidad de proteína en los puntos podría ser incrementado por un factor 5 de enriquecimiento de proteínas de membrana. Además, el uso de los estrechos intervalos de gradiente de pH de las tiras de IPG permite la aplicación de grandes cantidades de proteína. En este estudio se utilizó sólo 600 mg de proteínas totales, sin enriquecimiento de las proteínas de membrana, y una tira IPG amplia gama. Fuimos capaces de identificar un gran número de proteínas de superficie celular, de los cuales eran conocidos previamente como el 82% de membrana de proteínas asociadas.
Multiplexación
Para probar la superficie de las células de proteínas protocolo de etiquetado en un experimento DIGE Ettan con los tres colorantes 6, una serie de muestras de suero de agotadas las células CHO fueron recogidos y etiquetados proteínas de superficie celular en diferentes puntos temporales (Tabla 1). Las muestras fueron separados por electroforesis en 2-D. La elaboración de una norma interna para un experimento de células DIGE superficie es muy sencillo. En este caso, Cy 2 muestras de la superficie de células marcadas (desde todos los puntos de tiempo) se combinaron y se utiliza como estándar interno se aplica a cada gel 2-D. La superficie de los tres CyDye DIGE tintes Fluor mínimos marcados proteínas celulares de manera similar (datos no mostrados). Cambios en la expresión durante la privación de suero para muchas de las proteínas de superficie de la célula fueron detectados utilizando DeCyder 2-D de software (Fig. 4).
Fig. 4.
Cambio en la expresión de dos proteínas de la superficie celular durante la hambruna de células CHO-K1. Mapas de puntos se analizaron mediante DeCyder 2-D software de análisis diferencial.
Conclusiones
El nuevo protocolo Ettan DIGE para el etiquetado de la proteína de la superficie celular es rápido, fácil de use y muy específicas para el etiquetado de las proteínas de la superficie celular. Muchas nuevas proteínas de superficie de las células sólo se pueden detectar cuando se utiliza el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado. Más de 80 nuevas proteínas de la superficie celular de células CHO fueron detectados utilizando DeCyder 2-D software de análisis diferencial. Más del 80% de la superficie de los puntos identificados de células marcadas fueron las proteínas de membrana asociados.
Multiplexación se realiza mediante las tres CyDye DIGE tintes Fluor mínimo, y en combinación con DeCyder 2-D de software, este nuevo protocolo es una herramienta poderosa para el estudio de proteínas de superficie celular con todas las ventajas que se obtienen con la tecnología 2-D DIGE.
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Acknowledgments
Agradecemos al profesor Dontscho Kerjaschki, Mayrhofer Corina y Krieger Sigurd en el Instituto de Patología Clínica de la Universidad de Viena, Austria, por su colaboración.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
