Summary
在这里，我们描述培养的背根神经节感觉神经元的隔间钱伯斯编写和维护的技术。
Abstract
神经元的延伸，从细胞体拆下来支配靶组织，靶源性生长因子神经元的存活和功能的要求的轴突过程。神经营养因子具体要求，以维持生存和支配的感觉神经元的分化，但如何将这些目标源性神经营养因子的支配神经元细胞体沟通的问题已经超过30年的一个活跃的研究领域。神经营养因子的信号如何到达细胞体的最普遍接受的模型的建议，信令内涵体进行这个信号沿着轴突逆行。为了研究逆行运输，文化系统的最初设计由罗伯特Campenot，其中胞体从它们的轴突隔离。技术准备培养的感觉神经元概括选择性刺激神经元的终端发生以下靶源性神经营养因子在体内释放这些隔间商会。逆行信号的事件，需要长距离微管依赖逆行运输的神经退行性疾病的治疗具有重要意义。
Protocol
试剂的制备
- 胶原涂层 ：胶原蛋白外衣P35组织培养板，并放置在烤箱在37 ° C时2天前润滑的分隔。最后胶原蛋白的浓度应在0.71毫克/毫升0.001 ñ盐酸稀释。然后，添加1毫升每盘的混合物。
- 油脂装载机 ：为了填补油脂装载机，一个60ml的注射器必须先与康宁真空润滑脂填充。使用注射器填补油脂装载机，包装箔，然后高压灭菌45分钟。
- 聚四氟乙烯分隔的分频器，可每次实验后重新使用，但首先必须正确地清洗。从板卸下分配器，擦去所有剩余的油脂和硫酸为2天。从酸中取出后，冲洗3倍的水，煮沸20分钟，晾干，在一个玻璃P100培养皿和20分钟高压灭菌的地方。
- N2 -甲基纤维素 ：称取甲基纤维素1.5克，放置在500毫升的瓶子。添加搅拌棒，高压灭菌20分钟就干（这一点所有的工作必须是无菌的）。接下来，添加无血清媒体（N 2）500毫升，在寒冷的房间中，搅拌直至溶解。分装成50毫升conicals和冻结在-20 ° C。对于股票的工作，分装50毫升conicals的一成1ML管和冻结在-20 ° C。
- DRG的媒体 ：DMEM培养液，5％热灭活马血清，1％青霉素链霉素。
- 100ng/mL DRGN媒体的神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的股票浓度为1mg/ml。稀释成每个人的背根神经节媒体神经营养因子1:10,000。文化可以仅在NGF的增长，这改变了神经元在文化生存的补充。
注意 ：当需要时，浓度（阿糖胞苷）ARAC 0.3uM最终浓度在1微米和使用。这将抑制雪旺氏细胞和其他神经胶质细胞的生长。 - 在10ng/ml DRGN媒体 ：100ng/mL DRGN媒体（1:10）稀释与DRG的媒体。
设置所需的工具图1 。
隔间商会成立（启动前清扫这个过程1-2天）
- 请在涂胶原蛋白P35盘向外运动中的划伤。
- N2 -甲基广场30ul从头中间。设置菜放在一旁，直到分频器是润滑。
- 将一个23号鲁尔存根适配器油脂装载机。抓住一双90 °角止血特氟隆分压器和奠定它在显微镜下所面临的分压器持平。分压器跟踪与油脂，确保每次适配器适配器是从上一步中的油脂插入一个新的起点上，以便有连续线的油脂（见图表）。一旦油脂被应用到整个分，依次准备P35菜肴之一倒挂，并把它使N2 -甲基中间的车厢。按底部的菜用的镊子。请务必按分压器内部四角（左上角，右下角，右上角，左下角，在图所示的“X”）。
图2：润滑分配器的步骤
注 ：重要的是用力按压足够的油脂，使一个完全密封的菜，但如果添加太多的压力，轴突不会跨到侧面车厢。
拿起止血，翻过来，松开分压器。最后，坚决附加分压器中间车厢底部聚焦显微镜下的菜。随着油脂加载器，使一个小的障碍（0.25厘米），因此，一旦细胞被放置在中间舱，他们不能泄露出去。 - 后成立了文化，在每个侧面车厢DRG的媒体和地点在将保持在该细胞的孵化器。让文化坐了几个小时，然后检查有无泄漏。如果媒体已泄露到中间的车厢，然后文化是不可用的。
注 ：当第一次学习这种技术，它是重要的，成立超过一个实验需要的文化，几个将漏水。
图3：“好VS漏”文化
在隔间文化保持背根神经节神经元
- 第1天 ：100ng/mL DRGN媒体+ ARAC一边车厢，更换DRG的媒体。进行清扫，并添加细胞中心室（100000细胞）。
- 第2天 ：添加在10ng/ml媒体+ ARAC聚四氟乙烯分频器外，直到媒体中心舱的油脂阻隔与交流流体流动。
- 第3天 ：替换在一旁车厢媒体100ng/mL DRGN省略在10ng/ml DRGN省略ARAC ARAC和环绕声。
- 第6天 ：1ng/mL + ARAC和DRG的媒体+ ARAC环绕在一旁车厢替换的媒体。
- 第九天 ：进行试验使用。
图4：胞体和远端轴突的免疫组化图像
注意：改变媒体时，重要的是从每一方舱顶部的吸液。此外，从中间的车厢本身永远不会改变媒体，只有从环绕，并让它流在进入中心的油脂阻隔。
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Discussion
在这段视频中，我们已经演示了如何编写和维护用于培养DRG神经元的隔间商会。处理得当，这个系统可以从轴突细胞体内分离，以研究神经营养因子，其中跨长轴突信号机制。由于车厢之间的隔离流体，它允许没有受到影响的其他车厢选择性刺激或一室的治疗。隔间腔文化可以支持其他类型的细胞，包括从颈上神经节，视网膜神经节神经元和皮层神经元交感神经元。空间理解神经营养因子信号转导的神经退行性疾病的治疗提供了新的见解。一些神经退行性疾病，包括老年痴呆症，亨廷顿氏症和运动神经元疾病，都与轴突运输缺陷。最近的研究中使用了微流体的商会，而不是这些隔间商会。 4,5微流体商会成像分析的几个优点。
此前的研究测试，这些文化的能力，以防止扩散之间的轴突和胞体车厢1,3,6。这可以很容易地通过添加低浓度的，如台盼蓝染色仅一室，并寻找染料的扩散测试。应在24小时内很少或根本没有扩散可见。
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Acknowledgments
我们想感谢卡塔琳娜Cosker和斯蒂芬妮Courchesne有益的讨论。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
