Summary
Hier beschrijven we de techniek van het opstellen en onderhouden van gecompartimenteerd kamers voor het kweken van sensorische neuronen van de achterwortelganglia.
Abstract
Neuronen verlengen axonale processen die ver verwijderd zijn van het cellichaam te richten weefsels, waar de target-derived growth factoren die nodig zijn voor neuronale overleving en functie innerveren. Neurotrofinen zijn specifiek nodig zijn om de overleving en differentiatie van sensorische neuronen innerveren handhaven, maar de vraag hoe deze doelgroep afgeleide neurotrofinen mee aan het cellichaam van de neuronen innerveren is een fase van actief onderzoek meer dan 30 jaar. De meest geaccepteerde model van hoe neurotrofine signalen bereiken het cellichaam stelt voor dat de signalering endosomen retrogradely voeren dit signaal langs de axon. Om de retrograde transport studie werd een cultuur dat oorspronkelijk ontwikkeld door Robert Campenot, in welke cel lichamen zijn geïsoleerd van hun axonen. De techniek van het voorbereiden van deze gecompartimenteerd kamers voor het kweken van sensorische neuronen recapituleert de selectieve stimulatie van de zenuwuiteinden die zich voordoet in vivo volgende release van target-afgeleide neurotrofinen. Retrograde signalering gebeurtenissen die lange afstand microtubule afhankelijk retrograad transport nodig hebben belangrijke implicaties voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen.
Protocol
Bereiding van reagentia
- Collageen coating: collageen laag p35 weefselkweek-platen en plaats in een oven bij 37 ° C gedurende 2 dagen vóór smeren de verdelers. De uiteindelijke concentratie van collageen moet op 0,71 mg / ml verdund in 0,001 N HCl. Dan, voeg 1 ml mengsel per plaat.
- Grease laders: Om het vet loader te vullen, een 60ml spuit moet eerst worden gevuld met Corning vacuüm vet. Gebruik de spuit om het vet loader te vullen, wikkel in folie en vervolgens gedurende 45 minuten autoclaaf.
- Teflon verdelers: de verdelers kan opnieuw worden gebruikt na elk experiment, maar moet eerst goed worden gereinigd. Verwijder de verdeler van de plaat, veeg alle resterende vet en plaats in zwavelzuur voor 2 dagen. Na het verwijderen van het zuur, spoelen met water 3X, kook gedurende 20 minuten, laten drogen, in een glazen p100 petrischaal en autoclaaf gedurende 20 minuten.
- N2-methylcellulose: Weeg 1,5 g van methylcellulose en het in een 500ml fles plaats. Voeg een roerstaafje en autoclaaf gedurende 20 minuten droog (vanaf dit punt al het werk moet steriel). Voeg vervolgens 500 ml van serum vrije media (N 2), en roer in een koude kamer tot het oplost. Aliquot in 50 ml conicals en invriezen bij -20 ° C. Voor het werken voorraad, hoeveelheid een van de 50 mL conicals in 1 ml buizen en invriezen bij -20 ° C.
- DRG media: DMEM, 5% door warmte geïnactiveerd paard serum, en 1% penicilline streptomycine.
- 100ng/mL DRGN media: De voorraad concentratie van zowel zenuw groeifactor (NGF) en brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is 1mg/ml. Vul telkens van de neurotrofinen 1:10.000 in de DRG media. Culturen kan worden gekweekt in NGF alleen, dit verandert het complement van neuronen die overleven in de culturen.
Opmerking: Indien nodig, de concentratie van (cytosinearabinoside) AraC is 1uM en gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 0.3uM. Dit zal de groei vertragen van de Schwann-cellen en andere glia. - 10ng/mL DRGN media: Verdun de 100ng/mL DRGN media (1:10) met DRG media.
Figuur 1. Benodigd gereedschap voor het set-up
Het instellen van de compartimenten kamers (start dit proces 1-2 dagen voor de dissectie)
- Maak een kras in het midden van een collageen gecoat p35 schotel met een buitenwaartse beweging.
- Plaats 30ul van de N2-methylcellulose op het midden van de kras. Gereserveerd gerechten tot divider is ingevet.
- Bevestig een 23-gauge luer-pin adapter om het vet te loader. Pak de Teflon verdeler met een paar van de hoek van 90 ° hemostats en leg hem plat met de verdeler naar boven onder een microscoop. Trace van de verdeler met vet ervoor te zorgen dat elke keer dat de adapter is geplaatst op een nieuw startpunt van de adapter is aangesloten op het vet uit de vorige stap, zodat er een ononderbroken lijn van vet (zie diagram). Zodra het vet is toegepast op de gehele verdeler, draai een van de bereide gerechten p35 ondersteboven en plaats deze, zodat de N2-methylcellulose is over het midden compartiment. Druk op de bodem van de schotel met een pincet. Zorg ervoor dat u aan de binnenkant van de verdeler pers in vier hoeken (linksboven, rechtsonder, rechtsboven, linksonder, aangegeven in diagram met "X").
Figuur 2: Stappen om het smeren van de verdeler
Opmerking: Het is belangrijk om stevig genoeg drukt, zodat het vet een volledige afdichting met de schotel maakt, maar als er teveel druk wordt toegevoegd, de axonen niet kruisen in de zijvakken.
Pak de hemostats, draai hem om en ontspan de verdeler. Ten slotte, plaats de schaal met de verdeler stevig onder de microscoop zich richt op de onderkant van de middelste compartiment. Met het vet loader, dus zorg een kleine barrière (0,25 cm) dat wanneer de cellen zijn geplaatst in het middelste compartiment ze niet kunnen lekken. - Na het opzetten verschillende culturen, plaats DRG media in elk van de zijvakken en plaats het in een incubator waarin de cellen zullen worden gehandhaafd. Laat de culturen om te zitten voor een paar uur en daarna op lekkage te controleren. Als de media heeft gelekt in het middelste compartiment, dan is de cultuur is onbruikbaar.
Opmerking: Bij het eerste deze techniek te leren, is het belangrijk om het opzetten van meer culturen dan nodig zijn voor een experiment, zoals meerdere zal worden lek.
Figuur 3: "Good vs lek 'cultuur
Behoud van DRG neuronen in compartimenten culturen
- Dag 1: Vervang DRG media in de zijvakken met 100ng/mL DRGN media + AraC. Voer dissectie en voeg cellen tot het centrum compartiment (100.000 cellen).
- Dag 2: Voeg 10ng/mL media + AraC aan de buitenkant van de Teflon verdeler tot de media stroomt over het vet barrière en uitwisselingen vloeistof met het midden compartiment.
- Dag 3: Vervang media in de zijvakken te 100ng/mL DRGN weglating van de AraC en de surround met 10ng/mL DRGN het weglaten van het AraC.
- Dag 6: Vervang media in de zijvakken te 1ng/mL + AraC en de surround met DRG media + AraC.
- Dag 9: Gebruik voor experimenten.
Figuur 4: IHC beelden van cellichamen en distale axonen
Opmerking: Bij het wijzigen van de media, is het belangrijk om de vloeistof te zuigen uit de top van de beide zijden compartiment. Ook nooit veranderen de media uit de middelste compartiment zelf, alleen van de surround, en laat het stromen over het vet barrière naar het centrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video, hebben we aangetoond hoe voor te bereiden en gecompartimenteerd kamers te behouden voor het gebruik in het kweken van DRG neuronen. Goed uitgevoerd, dit systeem kan de scheiding van de cel lichaam van de axon om de mechanismen die neurotrofinen signaal over lange axonen te bestuderen. Omdat er vloeibare isolatie tussen de compartimenten, het zorgt voor selectieve stimulatie of behandeling van een compartiment zonder dat de andere compartimenten wordt aangetast. Gecompartimenteerd kamer culturen kunnen ondersteunen andere soorten cellen, waaronder sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia, retinale ganglion neuronen, en corticale neuronen. Ruimtelijk inzicht van neurotrofine signaaltransductie kunnen nieuwe inzichten in de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen. Verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Huntington en de motor neuron ziekte, worden geassocieerd met defecten in axonaal transport. Recente studies hebben gebruikt microfluïdische kamers in plaats van deze gecompartimenteerd kamers. De microfluïdische kamers 4,5 hebben verschillende voordelen voor de beeldvorming analyse.
Eerdere studies hebben getest het vermogen van deze culturen om diffusie te voorkomen dat tussen het axon en het cellichaam compartiment 1,3,6. Dit kan eenvoudig getest worden door het toevoegen van lage concentraties van een kleurstof, zoals trypan blauw naar een compartiment alleen, en kijk voor de verspreiding van de kleurstof. Er mag weinig of geen diffusie zichtbaar binnen 24 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Katharina Cosker en Stephanie Courchesne bedanken voor nuttige discussies.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
