Summary
Hier beschreiben wir die Technik der Herstellung und Aufrechterhaltung compartmented Kammern zur Kultivierung von sensorischen Neuronen der Spinalganglien.
Abstract
Neurons verlängern axonalen Prozessen, die weit vom Zellkörper entfernt werden, um Zielgewebe, wo target-derived growth Faktoren für das neuronale Überleben und die Funktion erforderlich sind, innervieren. Neurotrophine sind speziell erforderlich, um das Überleben und die Differenzierung von innervieren sensorischen Neuronen zu halten, aber die Frage, wie diese Ziel-derived Neurotrophine zum Zellkörper der Neuronen innervieren zu kommunizieren, hat eine Fläche von aktiver Forschung seit über 30 Jahren. Die am häufigsten akzeptierte Modell, wie Neurotrophin-Signale erreichen den Zellkörper schlägt vor, dass Signalisierung tragen dieses Signal retrograd entlang des Axons Endosomen. Um retrograden Transport Studie wurde eine Kultur, das ursprünglich von Robert Campenot, in dem Zellkörper von ihrer Axone isoliert entwickelt. Die Technik zur Herstellung dieser compartmented Kammern zur Kultivierung von sensorischen Neuronen rekapituliert die selektive Stimulation von Neuronen Terminals, die in vivo nach der Entlassung von Soll-derived Neurotrophine auftritt. Retrograde Signal-Ereignisse, Langstrecken-Mikrotubuli abhängig retrograden Transport benötigen haben wichtige Implikationen für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.
Protocol
Vorbereitung der Reagenzien
- Collagen-Beschichtung: Kollagen Mantel p35 Zellkulturplatten und in einem Ofen bei 37 ° C für 2 Tage vor dem Schmieren der Teiler. Die endgültige Konzentration von Kollagen sollten bei 0,71 mg / ml in .001 N HCl verdünnt werden. Dann fügen Sie 1 ml der Mischung pro Platte.
- Fett Lader: Um das Fett loader zu füllen, eine 60 ml Spritze muss zunächst mit Corning Vakuum Fett gefüllt werden. Verwenden Sie die Spritze mit dem Fett-Loader zu füllen, wickeln Sie es in Folie und dann Autoklaven für 45 Minuten.
- Teflon Teiler: die Teiler kann nach jedem Experiment wieder verwendet werden, sondern muss zuerst gründlich gereinigt werden. Entfernen Sie die Teiler von der Platte, wischen Sie alle verbleibenden Fett und in Schwefelsäure für 2 Tage. Nach dem Entfernen aus der Säure mit Wasser 3X, Kochen gründlich für 20 Minuten trocknen lassen, in ein Glas p100 Petrischale und Autoklaven für 20 Minuten.
- N2-Methylcellulose: abwiegen 1,5 g Methylcellulose und legen Sie es in einer 500ml Flasche. Fügen Sie einen Rührstab und Autoklaven für 20 Minuten auf dem Trockenen (ab diesem Zeitpunkt alle Arbeiten müssen steril sein). Als Nächstes fügen Sie 500 ml serumfreiem Medium (N 2), und rühren Sie in einem kalten Raum, bis sie sich auflöst. Aliquot in 50 mL konische und Einfrieren bei -20 ° C. Für die Arbeit Lager, Aliquot einer der 50 mL konische in 1 ml Tuben und bei -20 ° C.
- DRG-Medien: DMEM, 5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum und 1% Penicillin Streptomycin.
- 100ng/mL DRGN Medien: Die Aktie Konzentration beider nerve growth factor (NGF) und brain-derived neurotrophen Faktor (BDNF) ist 1mg/ml. Verdünnen Sie jede der Neurotrophine 1:10.000 in den DRG-Medien. Kulturen können in NGF allein angebaut werden, dies ändert die Ergänzung von Neuronen, die in den Kulturen überleben.
Hinweis: Bei Bedarf wird die Konzentration von (Cytosinarabinosid) AraC 1um und verwendet in einer Endkonzentration von 0.3uM. Dies hemmt das Wachstum von Schwann-Zellen und anderen Gliazellen. - 10ng/ml DRGN Medien: Verdünnen Sie die 100ng/mL DRGN Medien (1:10) mit DRG-Medien.
Abbildung 1. Werkzeuge für die Set-up benötigt
Einrichten des compartmented Kammern (Beginn dieses Prozesses 1-2 Tage vor der Dissektion)
- Machen Sie einen Kratzer in der Mitte eines Kollagen beschichtet p35 Schüssel mit einer passiven Bewegung.
- Legen Sie 30ul der N2-Methylcellulose auf die Mitte des kratzen. Set Geschirr beiseite, bis Teiler ist gefettet.
- Bringen Sie eine 23-Gauge-Luer-Steckadapter, um das Fett-Loader. Fassen Sie die Teflon Teiler mit einem Paar 90 °-Winkel Hämostatika und legen Sie es mit dem Teiler nach oben unter dem Mikroskop. Verfolgen Sie die Trennlinie mit Fett dafür sorgen, dass jedes Mal, wenn Sie den Adapter an einem neuen Ausgangspunkt der Adapter in das Fett aus dem vorherigen Schritt eingefügt wird so platziert, dass es eine kontinuierliche Reihe von Fett (siehe Diagramm). Sobald das Fett auf die gesamte Teiler angewendet wird, drehen Sie einen der vorbereiteten p35 Gerichte auf den Kopf und legen Sie sie so die N2-Methylcellulose ist über dem mittleren Fach. Drücken Sie auf den Boden der Schale mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, auf der Innenseite des Teilers in vier Ecken (oben links, unten rechts, oben rechts, unten links, im Diagramm durch "X" gekennzeichnet) drücken.
Abbildung 2: Schritte zum Einfetten der Teiler
Hinweis: Es ist wichtig, fest genug drücken, so dass das Fett eine vollständige Abdichtung mit dem Teller macht, aber wenn zu viel Druck hinzugefügt wird, die Axone nicht in die Seitentaschen überqueren.
Nehmen Sie den Hämostatika, umdrehen und Ausspannen der Teiler. Schließlich legen Sie die Schale mit dem Teiler fest unter dem Mikroskop mit Schwerpunkt auf der Unterseite der mittleren Fach angebracht. Mit der Fett-Loader, machen Sie eine kleine Barriere (.25 cm), so dass, wenn die Zellen in der mittleren Fach gestellt werden können sie nicht auslaufen. - Nachdem mehrere Kulturen, Ort DRG Medien in jedem der seitlichen Fächern und in einen Inkubator, in dem die Zellen aufrechterhalten werden eingestellt. Lassen Sie den Kulturen für mehrere Stunden sitzen und prüfen Sie dann auf Dichtheit prüfen. Wenn das Medium in das mittlere Fach ausgelaufen sind, dann wird die Kultur unbrauchbar.
Hinweis: Beim ersten Erlernen dieser Technik ist es wichtig, mehr Kulturen als für ein Experiment benötigt, da mehrere werden undicht.
Abbildung 3: "Good vs leaky" Kultur
Die Aufrechterhaltung DRG-Neuronen in compartmented Kulturen
- Tag 1: Ersetzen DRG Medien in den Seitentaschen mit 100ng/mL DRGN media + AraC. Führen Sie Dissektion und Zellen hinzufügen, um Fach-Center (100.000 Zellen).
- Tag 2: Add 10ng/ml media + AraC auf der Außenseite des Teflon Teiler, bis die Medien fließt über die Fett-Schranke und der Austausch Flüssigkeit mit der Fach-Center.
- Tag 3: Ersetzen Medien in den Seitentaschen zu 100ng/mL DRGN Weglassen des AraC und die Surround mit 10ng/ml DRGN Weglassen des AraC.
- Tag 6: Ersetzen Medien in den Seitentaschen zu 1ng/mL + AraC und die Surround mit DRG media + AraC.
- Tag 9: Verwenden Sie für Experimente.
Abbildung 4: IHC Bilder Zellkörper und Axone distal
Hinweis: Beim Wechsel der Medien, ist es wichtig, die Flüssigkeit aus der Spitze der einzelnen Seitenfach absaugen. Auch ändern sich nie die Medien aus dem mittleren Fach selbst, sondern nur aus den Surround, und lassen Sie es über die Fett-Schranke in das Zentrum fließen.
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Discussion
In diesem Video haben wir gezeigt, wie man sich vorbereiten und pflegen compartmented Kammern für den Einsatz in Kultivierung DRG-Neuronen. Alles richtig, dieses System Trennung der Zellkörper aus dem Axon, um Mechanismen, durch die Neurotrophine Signal über lange Axone zu studieren. Da es fluidische Trennung zwischen den Fächern, ermöglicht es zur selektiven Stimulation oder Behandlung von einem Fach, ohne die anderen Fächer berührt wird. Compartmented Kammer Kulturen unterstützt auch andere Zelltypen, einschließlich sympathischen Neuronen von der überlegenen Halsganglien, retinalen Ganglienzellen Neuronen und kortikalen Neuronen. Spatial Verständnis der Neurotrophin Signaltransduktion können neue Einblicke in Behandlungen von neurodegenerativen Erkrankungen bieten. Mehrere neurodegenerativen Erkrankungen, darunter Alzheimer, Chorea Huntington und Motoneuronerkrankung sind mit Defekten in axonalen Transport verbunden. Jüngste Studien haben mikrofluidischen Kammern statt dieser compartmented Kammern verwendet. Die mikrofluidischen Kammern 4,5 haben mehrere Vorteile für die Bildanalyse.
Frühere Studien haben die Fähigkeit dieser Kulturen eine Diffusion zwischen dem Axon und Zellkörper Fach 1,3,6 verhindern getestet. Dies kann leicht durch Zugabe von geringen Konzentrationen eines Farbstoffes wie Trypanblau, um ein Fach nur, und suchen Sie nach Diffusion des Farbstoffes getestet werden. Es sollte wenig oder keine Diffusion sichtbar innerhalb von 24 Stunden.
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Acknowledgments
Wir möchten Katharina Cosker und Stephanie Courchesne für hilfreiche Diskussionen danken.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
