Summary
यहाँ हम तैयारी और पृष्ठीय रूट ganglia के संवेदी न्यूरॉन्स संवर्धन के लिए compartmented कक्षों को बनाए रखने की तकनीक का वर्णन.
Abstract
न्यूरॉन्स axonal प्रक्रियाओं है कि सेल शरीर से दूर हटा रहे हैं करने के लिए लक्ष्य के ऊतकों, जहां लक्ष्य व्युत्पन्न वृद्धि कारक neuronal अस्तित्व और समारोह के लिए आवश्यक हैं अंदर आना विस्तार. Neurotrophins विशेष रूप से और संवेदी न्यूरॉन्स innervating के अस्तित्व और भेदभाव को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन कैसे ये लक्ष्य प्राप्त neurotrophins innervating न्यूरॉन्स की सेल शरीर के लिए संवाद का सवाल 30 से अधिक वर्षों के लिए सक्रिय अनुसंधान के एक क्षेत्र कर दिया गया है. कैसे neurotrophin संकेतों सेल शरीर तक पहुँचने का सबसे अधिक स्वीकार किए जाते हैं मॉडल का प्रस्ताव है कि सिगनल यह संकेत अक्षतंतु साथ ले retrogradely endosomes. आदेश में प्रतिगामी परिवहन का अध्ययन करने के लिए, एक संस्कृति प्रणाली मूल रॉबर्ट Campenot, जो सेल शरीर में उनके axons से अलग कर रहे हैं द्वारा तैयार किया गया था. संवर्धन न्यूरॉन्स संवेदी न्यूरॉन टर्मिनलों के चुनिंदा उत्तेजना का स्मरण दिलाता है कि लक्ष्य प्राप्त neurotrophins के vivo निम्न रिलीज में होता है के लिए इन compartmented कक्षों की तैयारी की तकनीक. प्रतिगामी संकेत घटनाओं है कि लंबी दूरी microtubule निर्भर प्रतिगामी परिवहन की आवश्यकता neurodegenerative विकारों के उपचार के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव है.
Protocol
अभिकर्मकों की तैयारी
- कोलेजन कोटिंग: कोलेजन कोट P35 टिशू कल्चर प्लेट और एक ओवन में 37 में जगह ° सी डिवाइडर चिकनाई से पहले 2 दिन के लिए. कोलेजन के अंतिम एकाग्रता 0.71 मिलीग्राम / मिलीलीटर .001 एन एचसीएल में पतला होना चाहिए. फिर, प्लेट प्रति मिश्रण का 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- चर्बी लोडर: आदेश में तेल लोडर को भरने के लिए, पहले एक 60ml सिरिंज Corning वैक्यूम तेल के साथ भरा जाना चाहिए . तेल लोडर भरने, यह पन्नी में लपेट और फिर 45 मिनट के लिए आटोक्लेव सिरिंज का प्रयोग करें.
- Teflon डिवाइडर: एक प्रयोग के बाद डिवाइडर किया जा सकता है फिर से इस्तेमाल किया, लेकिन पहले ठीक से साफ होना चाहिए . थाली से विभक्त निकालें, 2 दिनों के लिए बंद शेष और सल्फ्यूरिक एसिड में जगह तेल के सभी पोंछ. एसिड से हटाने के बाद, पानी 3X फोड़ा, के साथ 20 मिनट के लिए, के लिए सूखी अनुमति देते हैं, एक गिलास P100 पेट्री और 20 मिनट के लिए पकवान आटोक्लेव में जगह कुल्ला.
- N2-methylcellulose: methylcellulose के 1.5g वजन और यह एक 500ml बोतल में जगह है . हलचल पट्टी जोड़ें और सूखी पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव (इस बिंदु से सभी काम बाँझ होना चाहिए). अगला, 500 सीरम स्वतंत्र मीडिया (2 एन) के MLS जोड़ने के लिए, और एक ठंडे कमरे में हलचल जब तक यह घुल. 50 एमएल conicals और फ्रीज में -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य काम शेयर, 1ml ट्यूबों में 50 एमएल conicals के एक और -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य फ्रीज के लिए
- DRG मीडिया: DMEM, 5% हीट निष्क्रिय घोड़े सीरम, और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन.
- 100ng/mL DRGN मीडिया: दोनों तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) और मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) के शेयर एकाग्रता 1mg/mL है. DRG मीडिया में 1:10,000 neurotrophins के प्रत्येक पतला. संस्कृतियों NGF अकेले में उगाया जा सकता है है, यह न्यूरॉन्स कि संस्कृतियों में बच के पूरक बदल.
नोट: जब जरूरत है, AraC (साइटोसिन arabinoside) की एकाग्रता 1um और 0.3uM की अंतिम एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है. यह श्वान कोशिकाओं और अन्य glia के विकास को बाधित करेगा. - 10ng/mL DRGN मीडिया: DRG मीडिया 100ng/mL DRGN मीडिया (01:10) के साथ पतला .
चित्रा 1 सेट अप के लिए आवश्यक उपकरण
स्थापना compartmented कक्षों (इस प्रक्रिया को 1-2 दिन शुरू विच्छेदन से पहले)
- एक जावक गति के साथ एक कोलेजन लेपित P35 पकवान के बीच में एक खरोंच बनाओ.
- N2-methylcellulose की खरोंच के बीच पर प्लेस 30ul. व्यंजन अलग सेट जब तक विभक्त greased है.
- तेल लोडर के लिए एक 23 गेज luer ठूंठ एडाप्टर संलग्न. 90 ° कोण hemostats की एक जोड़ी के साथ पकड़ Teflon विभक्त और यह एक खुर्दबीन के नीचे का सामना करना पड़ विभक्त के साथ फ्लैट करना. तेल सुनिश्चित करें कि हर बार एक नया प्रारंभिक बिंदु एडाप्टर पिछले कदम से तेल में डाला जाता है एडाप्टर पर रखा है, इतना है कि तेल की एक सतत लाइन है (आरेख देखें) बनाने के साथ विभक्त ट्रेस. एक बार तेल पूरे विभक्त करने के लिए लागू किया जाता है, एक तैयार P35 व्यंजन का उल्टा बारी है और यह जगह तो N2 methylcellulose मध्यम डिब्बे से अधिक है. चिमटी की एक जोड़ी के साथ डिश के तल पर नीचे प्रेस. चार कोनों (ऊपरी बाएँ निचले सही, ऊपरी दाएँ निचले बाएँ, "एक्स" द्वारा चित्र में संकेत) में विभक्त के अंदर पर प्रेस करने के लिए सुनिश्चित करें.
चित्रा 2: विभक्त चिकनाई के लिए कदम
नोट: यह महत्वपूर्ण है पर्याप्त मजबूती प्रेस ताकि तेल पकवान के साथ एक पूरी तरह से सील बनाता है, लेकिन अगर बहुत ज्यादा दबाव जोड़ा जाता है, axons पक्ष डिब्बों में नहीं पार कर जाएगा.
Hemostats उठाओ, इसे मोड़ पर और unclamp विभक्त. अंत में, दृढ़ता से मध्य डिब्बे के नीचे पर ध्यान केंद्रित खुर्दबीन के नीचे संलग्न विभक्त के साथ पकवान जगह है. तेल लोडर के साथ, एक छोटी सी बाधा (0.25 सेमी) तो है कि एक बार कोशिकाओं मध्यम डिब्बे में रखा जाता है वे बाहर लीक नहीं कर सकते हैं. - बाद कई संस्कृतियों, जगह पक्ष डिब्बों में से प्रत्येक में DRG मीडिया और एक मशीन में जो कोशिकाओं को बनाए रखा जाएगा में जगह सेट करने के. संस्कृतियों के कई घंटे के लिए बैठने के लिए और फिर रिसाव की जांच करने के लिए अनुमति दें. यदि मीडिया मध्य डिब्बे में लीक किया गया है, तो संस्कृति व्यर्थ है.
नोट: जब पहली बार इस तकनीक सीखने, यह महत्वपूर्ण है अधिक संस्कृतियों की तुलना में एक प्रयोग के लिए की जरूरत है स्थापित करने के लिए, के रूप में कई टपकाया हो जाएगा.
चित्रा 3: "अच्छा बनाम टपकाया संस्कृति"
Compartmented संस्कृतियों में बनाए रखने DRG न्यूरॉन्स
- दिन 1: 100ng/mL DRGN + मीडिया AraC के साथ साइड डिब्बों में मीडिया DRG बदलें . विच्छेदन प्रदर्शन और केंद्र डिब्बे (100,000 कोशिकाओं) कोशिकाओं को जोड़ने.
- दिन 2: Teflon विभक्त के बाहर AraC 10ng/mL + मीडिया जोड़ें जब तक मीडिया तेल और केंद्र डिब्बे के साथ आदान - प्रदान द्रव अवरोध पर बहती है .
- 3 दिन: साइड डिब्बों में मीडिया 100ng/mL DRGN 10ng/mL DRGN AraC omitting के साथ AraC और चारों ओर omitting बदलें .
- दिन 6: 1ng/mL + AraC और AraC DRG + मीडिया के साथ घेर पक्ष डिब्बों में मीडिया बदलें.
- दिन 9: प्रयोग के लिए उपयोग करें.
चित्रा 4: सेल निकायों और बाहर का axons के आईएचसी छवियों
नोट: जब मीडिया को बदलने, यह महत्वपूर्ण है ओर प्रत्येक डिब्बे के ऊपर से तरल aspirate. इसके अलावा मध्यम डिब्बे से ही बदलने के लिए, कभी नहीं मीडिया, चारों ओर से ही है, और इसे केंद्र में तेल की बाधा पर प्रवाह.
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Discussion
इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन किया है कैसे तैयार करने और संवर्धन DRG न्यूरॉन्स में उपयोग के लिए compartmented कक्षों को बनाए रखने. ठीक से हो गया, इस प्रणाली अक्षतंतु से सेल शरीर की जुदाई की अनुमति देता है क्रम में करने के लिए तंत्र है जिसके द्वारा neurotrophins लंबे axons भर में संकेत का अध्ययन. के बाद से वहाँ fluidic डिब्बों के बीच अलगाव है, यह अन्य डिब्बों को प्रभावित किया जा रहा बिना चयनात्मक एक डिब्बे की उत्तेजना या उपचार के लिए अनुमति देता है. Compartmented चैम्बर संस्कृतियों बेहतर ग्रीवा ganglia, रेटिनल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स, और cortical न्यूरॉन्स से सहानुभूति न्यूरॉन्स सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं का समर्थन कर सकते हैं. Neurotrophin संकेत transduction के स्थानिक समझ neurodegenerative विकारों के उपचार में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है. अल्जाइमर रोग, Huntington रोग और मोटर न्यूरॉन रोग सहित कई neurodegenerative विकारों, axonal परिवहन में दोषों के साथ जुड़े रहे हैं. हाल के अध्ययनों से microfluidic के बजाय कक्षों इन compartmented कक्षों का इस्तेमाल किया है. microfluidic 4,5 कक्षों इमेजिंग विश्लेषण के लिए कई फायदे हैं.
पूर्व अध्ययनों इन संस्कृतियों अक्षतंतु और सेल शरीर 1,3,6 डिब्बे के बीच प्रसार को रोकने की क्षमता का परीक्षण किया है. यह आसानी से एक ही डिब्बे trypan नीले रंग के रूप में एक डाई के कम सांद्रता जोड़ने, और डाई के प्रसार के लिए देखो द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. वहाँ कम या कोई 24 घंटे के भीतर दिखाई प्रसार होना चाहिए.
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Acknowledgments
हम Katharina Cosker और स्टेफ़नी Courchesne उपयोगी विचार - विमर्श के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
