Summary
ここでは、後根神経節の培養感覚ニューロンについてはコンパートメント室を準備し、維持するテクニックについて説明します。
Abstract
ニューロンは、遠くのターゲット由来の成長因子がニューロンの生存と機能に必要な標的組織を、支配するために細胞体から削除されている軸索のプロセスを拡張します。ニューロトロフィンは、特に感覚神経の神経支配の生存と分化を維持することが義務付けられていますが、これらの標的由来神経栄養因子は神経支配ニューロンの細胞体への通信方法の質問は、30年以上にわたり活発な研究分野となっている。ニューロトロフィンのシグナルが細胞体に到達する方法の最も一般的に受け入れられているモデルは、シグナルが軸索に沿って逆行性にこの信号を運ぶエンドソームことを提案している。逆行性輸送を研究するために、培養系は、もともと細胞体がそれらの軸索から隔離されているロバートCampenot、によって考案されました。培養感覚ニューロンの反復するターゲット由来神経栄養因子のin vivoで、次のリリースで発生するニューロンの端末の選択刺激のためにこれらのコンパートメントチャンバーの準備のテクニック。長距離微小管依存性の逆行輸送を必要とする逆行性シグナル伝達事象は、神経変性疾患の治療のために重要な意味を持っている。
Protocol
試薬の調製
- コラーゲンコーティング ：オーブンでコラーゲンコートp35の組織培養プレートと場所37℃で分周器を給脂する前に2日間C。コラーゲンの最終濃度は0.001 N塩酸で希釈した0.71 mg / mlのになっているはず。その後、プレート当たり混合物を1 mlを加える。
- グリースローダー ：グリースローダーを埋めるために、60mlの注射器が最初にコーニングの真空グリースを封入する必要があります。グリースローダーを埋めるために注射器を使用して、45分間オートクレーブしてホイルに包んでと。
- テフロン仕切り ：分周器をそれぞれの実験後に再使用することができますが、最初の適切に洗浄する必要があります。プレートから分周器を取り外す、2日間硫酸の残りのグリースと場所のすべてをふき取ってください。酸から削除した後、水3X、20分間沸騰とリンス、、20分間ガラスP100ペトリ皿とオートクレーブ内の場所を乾燥することができます。
- N2 -メチルセルロース ：メチルセルロースの1.5グラムを秤量し、500ミリリットル瓶に入れます。攪拌棒を追加し、乾燥した上で20分間オートクレーブ（この時点から、すべての作業は無菌でなければならない）。次に、無血清培地（N 2）、500 MLSを追加し、それが溶けるまで寒い部屋でかき混ぜる。 -20℃で50mLのconicalsと凍結に分注し-20℃で作業用ストック、1mLのチューブに50 mLのconicalsの一分注して凍結するための
- DRGメディア ：DMEM、5％熱不活化ウマ血清、及び1％ペニシリンストレプトマイシン。
- 100ng/mlのDRGNメディア：両方の神経成長因子（NGF）及び脳由来神経栄養因子（BDNF）の株式の濃度は1mg/mLです。 DRGのメディアへのニューロトロフィン1:10,000のそれぞれを希釈する。培養物はNGF単独で成長させることができる、これは文化の中で生き残るニューロンの補数を変更します。
注 ：必要なときは、（シトシンアラビノシド）AraCの濃度が1uMと0.3uMの最終濃度で使用されている。これは、シュワン細胞や他のグリア細胞の成長を抑制します。 - 10ng/mL DRGNメディア ：DRGのメディアで100ng/mlのDRGNメディア（1:10）希釈。
セットアップに必要な図1。ツール
コンパートメントチャンバーのセットアップ（解剖前に1〜2日、このプロセスを開始する）
- 外側への動きとコラーゲンコーティングしたp35の皿の中央にスクラッチを行う。
- スクラッチの真ん中でN2 -メチルセルロースの30ul場所。分周器が油を塗ったされるまで、脇に料理を設定します。
- グリースのローダに23ゲージルアースタブアダプタを取り付けます。グリップテフロンの90 °の角度止血のペアで分周器とは、顕微鏡下で上向きに分周器とそれを寝かせて。グリースは、それぞれの時間は、アダプタが新しい出発点に置かれているグリースの連続的なラインが存在するようにアダプタが前のステップからグリースに挿入されていることを確認すると分周器をトレース（図を参照）。グリスが全体の分周器に適用されるとN2 -メチルセルロースは、中央の区画を超えているので、上下逆さまに準備したp35の料理のいずれかをオンにして置きます。ピンセットで皿の底を下に押してください。四隅（"X"によって図に示されている左上、右下、右上、左下、）で分周器の内側に押してください。
図2：分周器を給脂する手順
注 ：これは、グリースが料理と完全なシールを作るが、過剰な圧力が付加されている場合、軸索は側の区画にまたがることがないようにしっかりと十分に押すことが重要です。
、止血を拾うそれを裏返して分周器をアンクランプ。最後に、しっかりと中間のコンパートメントの底部に焦点を当てて顕微鏡下に取り付けられた分圧器を使って皿を置く。グリースのローダーで、細胞が中央コンパートメント内に配置されると、彼らが漏れないことができるように小さな障壁（0.25 cm）を行う。 - 複数の文化、サイド区画のそれぞれの場所のDRGのメディアと細胞が維持されるのインキュベーター内で場所を設定した後。文化は数時間放置し、漏れをチェックすることができます。メディアが真ん中のコンパートメントに流出している場合には、文化は使用不能です。
注 ：いくつかが漏れになるので最初にこのテクニックを学ぶとき、それは、実験に必要な数よりも多くの文化を設定することが重要です。
図3："グッドVS漏れ"文化
コンパートメントの文化の維持DRGニューロン
- 1日目 ：100ng/mlのDRGNメディア+ AraCのある側のコンパートメントにDRGメディアを交換してください。解剖を行い、中央の区画（100,000セル）にセルを追加。
- 2日目 ：メディアセンターのコンパートメントを持つグリースの障壁と交換流体を介して流れるまで、テフロンの分周器の外側に10ng/mLメディア+ AraCのを追加。
- 3日目 ：10ng/mL DRGNはAraCのを省略してAraCのとサラウンドを省略100ng/mlのDRGNする側のコンパートメントでメディアを交換してください。
- 6日目 ：1ng/mL + AraCのとDRGメディア+ AraCのあるサラウンドにサイドコンパートメント内のメディアを交換してください。
- 9日目 ：実験のために使用して下さい。
図4：細胞体と軸索遠位のIHC画像
注：メディアを変更する場合、それは各サイド区画の上部から液体を吸引することが重要です。また、唯一のサラウンドから、中間のコンパートメント自体からメディアを変更していない、そして中央にグリスの障壁を越えて、流れてみましょうね。
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Discussion
このビデオでは、我々は培養DRGニューロンにおける使用のためにコンパートメント室を準備し、維持する方法を示している。正しく行えば、このシステムは、ニューロトロフィンは、長い軸索を介して通知されるメカニズムを研究するために、軸索から細胞体を分離することができます。コンパートメントの間に流体分離があるので、それは他のコンパートメントが影響を受けることなく、一区画の選択的な刺激や治療が可能になります。コンパートメントチャンバー培養は上頚神経節から交感神経ニューロン、網膜神経節ニューロン、および皮質ニューロンを含む他の細胞型をサポートできます。ニューロトロフィンのシグナル伝達の空間的な理解は、神経変性疾患の治療に新たな洞察を提供することがあります。アルツハイマー病、ハンチントン病や運動ニューロン病を含むいくつかの神経変性疾患は、軸索輸送の欠陥に関連付けられています。最近の研究では、マイクロ流体チャンバーの代わりにこれらのコンパートメントチャンバーを使用している。 4,5マイクロ流体チャンバーは、画像解析のためのいくつかの利点があります。
先行研究では、軸索と細胞体のコンパートメント1,3,6の間の拡散を防ぐために、これらの培養物の能力をテストしている。これは簡単にだけ一区画にトリパンブルーなどの色素の低濃度を加えることによってテストされ、染料の拡散を探すことができます。 24時間以内可視ほとんど、またはまったく拡散があるはずです。
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Acknowledgments
我々は、有用な議論をカタリーナCoskerとステファニーCourchesneに感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
