Summary
Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.
Abstract
Neurônios estender os processos axonal que estão longe do corpo celular para inervar tecidos-alvo, onde alvo derivado fatores de crescimento são necessários para a sobrevivência neuronal e na função. Neurotrofinas são especificamente necessárias para manter a sobrevivência e diferenciação de neurônios sensoriais que inervam mas a questão de como esses neurotrofinas-alvo derivado comunicar para o corpo celular dos neurônios que inervam tem sido uma área de pesquisa ativa por mais de 30 anos. O modelo mais comumente aceita de como sinais de neurotrofina chegar ao corpo celular propõe que a sinalização endossomos transportar este sinal retrogradamente ao longo do axônio. A fim de estudar o transporte retrógrado, um sistema de cultura foi originalmente concebido por Robert Campenot, em que os corpos celulares estão isolados de seus axônios. A técnica de preparação destas câmaras compartimentado para recapitula cultura sensorial neurônios a estimulação seletiva dos terminais dos neurônios que ocorre na liberação in vivo de seguir-alvo derivado neurotrofinas. Retrógrada eventos que requerem sinalização de longo alcance microtúbulos transporte retrógrado dependentes têm implicações importantes para o tratamento de doenças neurodegenerativas.
Protocol
Preparação de reagentes
- Revestimento de colágeno: colágeno casaco p35 placas de cultura de tecidos e coloque em um forno a 37 ° C por 2 dias antes da lubrificação os divisores. A concentração final de colágeno deve ser a 0,71 mg / ml diluída em HCl 0,001 N. Em seguida, adicionar 1 ml da mistura por placa.
- Carregadores de graxa: A fim de preencher o carregador de graxa, uma seringa de 60mL primeiro deve ser preenchido com Corning graxa de vácuo. Use a seringa para encher o carregador de graxa, envolvê-la em papel alumínio e depois autoclave por 45 minutos.
- Teflon divisores: os divisores podem ser reutilizados depois de cada experiência, mas deve primeiro ser devidamente limpos. Remover o divisor da placa, limpe toda a graxa restante e coloque em ácido sulfúrico por 2 dias. Após a remoção do ácido, lavar com água ferver, 3X por 20 minutos, deixar secar, coloque em um prato de vidro petri p100 e autoclave por 20 minutos.
- N2-metilcelulose: Pesar 1,5 g de metilcelulose e colocá-lo em uma garrafa de 500ml. Adicionar uma barra de agitação e autoclave por 20 minutos a seca (a partir deste ponto todo o trabalho deve ser estéril). Em seguida, adicione 500 ml de soro de mídia livre (N 2), e mexa em uma sala fria até que se dissolva. Alíquota em 50 conicals mL e congelar a -20 ° C. Para trabalhar ações alíquota, uma das 50 conicals mL em tubos de 1 ml e congelar a -20 ° C.
- DRG mídia: DMEM, 5% soro de cavalo calor inativada, e 1% de estreptomicina penicilina.
- 100ng/mL DRGN mídia: A concentração de ações de ambas fator de crescimento neural (NGF) e cérebro fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é 1mg/mL. Diluir cada uma das neurotrofinas 1:10.000 na mídia DRG. Culturas podem ser cultivadas em NGF sozinho, isso altera o complemento de neurônios que sobrevivem nas culturas.
Nota: Quando necessário, a concentração de (citosina arabinosídeo) ARAC é 1um e usado em uma concentração final de 0.3uM. Isso vai inibir o crescimento de células de Schwann e células gliais outros. - 10ng/ml DRGN mídia: Diluir o 100ng/mL DRGN media (1:10) com a mídia DRG.
Figura 1. Ferramentas necessárias para set-up
Criação de câmaras compartimentada (iniciar este processo de 1-2 dias antes da dissecção)
- Faça um arranhão no meio de um prato de colágeno p35 revestido com um movimento para fora.
- 30ul lugar de metilcelulose N2-on no meio do zero. Conjunto de pratos de lado até divisor é lubrificada.
- Anexar um adaptador de 23-gauge esboço luer para o carregador de graxa. Divisor de aderência do Teflon com um par de 90 ° hemostats ângulo e coloque-o deitado, com o divisor para cima sob um microscópio. Traçar o divisor com graxa certificando-se que cada vez que o adaptador é colocado em um novo ponto de partida o adaptador é inserido na graxa da etapa anterior para que haja uma linha contínua de graxa (ver diagrama). Uma vez que a graxa é aplicada ao divisor inteiro, por sua vez um dos pratos preparados p35 de cabeça para baixo e colocá-lo de modo que o N2 metilcelulose é sobre o compartimento do meio. Pressione para baixo no fundo do prato com um par de pinças. Certifique-se de imprensa no interior do divisor em quatro cantos (superior esquerdo, inferior direito, superior direito, inferior esquerdo, indicado no diagrama por "X").
Figura 2: Passos para lubrificar o divisor
Nota: É importante pressionar firmemente o suficiente para que a graxa faz uma vedação completa com o prato, mas se muita pressão é adicionado, os axônios não vai cruzar os compartimentos laterais.
Pegue o hemostats, vire-o e unclamp o divisor. Por último, coloque o prato com o divisor firmemente presa sob o microscópio com foco na parte inferior do compartimento do meio. Com o carregador de graxa, fazer uma pequena barreira (0,25 centímetros), de modo que uma vez que as células são colocadas no compartimento central não podem vazar. - Depois de ter criado várias culturas, a mídia local DRG em cada um dos compartimentos laterais e coloque em uma incubadora na qual as células serão mantidas. Permitir que as culturas para sentar-se por várias horas e depois verificar se há vazamento. Se a mídia vazou dentro do compartimento do meio, então a cultura é inutilizável.
Nota: Ao primeiro aprender esta técnica, é importante a criação de culturas mais do que o necessário para uma experiência, como várias será furado.
Figura 3: "Boa vs leaky" cultura
Manutenção de neurônios DRG em culturas compartmented
- Dia 1: Substituir DRG media nos compartimentos laterais com 100ng/mL DRGN media + ARAC. Realizar dissecção e adicionar células para o compartimento central (100 mil células).
- Dia 2: Adicionar 10ng/ml media + ARAC para o exterior do divisor de Teflon até que a mídia flui sobre a barreira de graxa e fluido intercâmbio com o compartimento central.
- Dia 3: Substitua media nos compartimentos laterais para 100ng/mL DRGN omitindo a ARAC eo surround com 10ng/ml DRGN omitindo a ARAC.
- Dia 6: Substitua media nos compartimentos laterais para 1ng/mL + ARAC eo surround com DRG media + ARAC.
- Dia 9: Use para a experimentação.
Figura 4: imagens IHC de corpos celulares e axônios distais
Nota: Ao mudar a mídia, é importante para aspirar o líquido da parte superior do compartimento de cada lado. Além disso, nunca alterar a mídia a partir do compartimento central em si, apenas a partir do surround, e deixe fluir por cima da barreira de graxa no centro.
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Discussion
Neste vídeo, demonstramos como se preparar e manter câmaras compartimentado para uso em neurônios DRG cultura. Feito corretamente, este sistema permite a separação do corpo celular do axônio para estudar mecanismos pelos quais neurotrofinas sinal através axônios longos. Uma vez que não é o isolamento fluídico entre os compartimentos, que permite a estimulação seletiva ou tratamento de um compartimento sem a outros compartimentos sendo afetados. Culturas câmara compartimentada pode suportar outros tipos de células, incluindo neurônios simpáticos do gânglio cervical superior, os neurônios ganglionares da retina e neurônios corticais. Compreensão espacial de neurotrofina transdução de sinal pode fornecer insights romance em tratamentos de doenças neurodegenerativas. Várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Huntington ea doença do neurônio motor, estão associadas a defeitos no transporte axonal. Estudos recentes têm utilizado câmaras microfluídicos em vez de estas câmaras compartimentados. As câmaras de 4,5 microfluídicos têm várias vantagens para a análise de imagem.
Estudos anteriores testaram a capacidade dessas culturas para evitar a difusão entre o axônio eo compartimento corpo celular 1,3,6. Isto pode ser facilmente testada pela adição de baixas concentrações de um corante, como azul de tripano para um compartimento apenas, e olhar para a difusão do corante. Deve haver pouca ou nenhuma divulgação visíveis dentro de 24 horas.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Katharina Cosker e Stephanie Courchesne para discussões úteis.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
