Summary
Här beskriver vi tekniken för att förbereda och underhålla fackindelade kammare för odling sensoriska nervceller i dorsalrotsganglier.
Abstract
Nervceller förlänga axonal processer som ligger långt från cellkroppen till innerverar målvävnader, där mål-derived growth faktorer krävs för neuronal överlevnad och funktion. Neurotrofinernas är specifikt krävs för att upprätthålla överlevnad och differentiering av innervating sensoriska neuroner, men frågan om hur dessa mål som härrör neurotrofinernas meddela cellkroppen av innervating nervceller har varit ett område med aktiv forskning i över 30 år. Den mest allmänt accepterade modellen för hur neurotrophin signaler når cellkroppen föreslår att signalering endosomes bära denna signal retrogradely längs axonet. För att studera retrograd transport, var en kultur system som ursprungligen utvecklades av Robert Campenot, i vilken cell organ är isolerade från sina axoner. Tekniken att förbereda dessa fackindelade kammare för odling sensoriska neuroner rekapitulerar den selektiva stimulering av neuron terminaler som sker in vivo efter utsläpp av mål-derived neurotrofinernas. Retrograd signalering händelser som kräver lång räckvidd mikrotubuli beroende retrograd transport har viktiga konsekvenser för behandling av neurodegenerativa sjukdomar.
Protocol
Beredning av reagenser
- Kollagen beläggning: kollagen päls P35 vävnadsodling tallrikar och placera i en ugn vid 37 ° C i 2 dagar innan smörjning av avdelare. Den slutliga koncentrationen av kollagen bör vara 0,71 mg / ml utspätt i 0,001 N HCl. Lägg sedan till 1 ml av blandningen per platta.
- Fett lastare: För att fylla fett Loader måste en 60ml sprutan först fyllas med Corning vakuum fett. Använd sprutan för att fylla fett lastaren, linda in det i folie och sedan autoklav i 45 minuter.
- Teflon avdelare: de avdelare kan återanvändas efter varje experiment utan måste först rengöras ordentligt. Ta bort divider från plattan, torka av alla kvarvarande fett och plats i svavelsyra i 2 dagar. Efter att från syra, skölj med vatten 3X, koka i 20 minuter, låt torka, lägg i ett glas P100 petriskål och autoklav i 20 minuter.
- N2-metylcellulosa: Väg upp 1,5 g metylcellulosa och placera den i en 500 ml flaska. Lägg till en omrörare och autoklav det i 20 minuter på torra (från denna punkt allt arbete måste vara sterila). Lägg sedan till 500 ml av serum fria medier (N 2) och rör i ett kallt rum tills det löser sig. Fördela i 50 ml conicals och frys vid -20 ° C. För arbete lager, uppmätt en av de 50 ml conicals i 1 mL rör och fryser vid -20 ° C.
- DRG media: DMEM, 5% värmeinaktiverad häst serum, och 1% penicillin streptomycin.
- 100ng/mL DRGN medier: lager koncentration av både nervtillväxtfaktor (NGF) och brain-neurotrofa faktor (BDNF) är 1mg/ml. Späd varje neurotrofinernas 1:10,000 i DRG media. Kulturer kan odlas i NGF ensam, detta förändrar komplement av nervceller som överlever i de kulturer.
Anm: Vid behov, är koncentrationen av (cytosin arabinoside) Arac 1um och användas på en slutlig koncentration av 0.3uM. Detta kommer att hämma tillväxten av Schwann celler och andra Glia. - 10ng/mL DRGN media: Späd den 100ng/mL DRGN media (1:10) med DRG medier.
Figur 1. Verktyg som behövs vid installation
Ställa in fackindelade kamrarna (påbörja denna process 1-2 dagar före dissekering)
- Gör en repa i mitten av en kollagen belagd P35 rätt med ett yttre rörelse.
- Plats 30ul av N2-metylcellulosa på mitten av scratch. Ställ rätter åt sidan tills delaren är smord.
- Fäst en 23-gauge luer påbörjad adaptern till fett lastaren. Greppa Teflon avdelare med ett par 90 ° vinkel peanger och lägg den platt med avdelare uppåt under ett mikroskop. Spåra divider med fett att se till att varje gång adaptern är placerad på en ny startpunkt adaptern sätts in i fett från föregående steg så att det finns en obruten linje av fett (se diagram). När fett tillämpas på hela avdelare, slå en av det beredda P35 rätter upp och ner och placera den så att N2-metylcellulosa är över det mellersta facket. Tryck ned på botten av skålen med en pincett. Se till att trycka på insidan av avdelare i fyra hörn (uppe till vänster, nedre högra, övre högra, nedre vänstra, som anges i diagram med "X").
Figur 2: Åtgärder för att smörja avdelare
OBS: Det är viktigt att trycka fast nog så att fettet gör en komplett tätning med skålen, men om för mycket press läggs kommer axoner inte korsa in i sidofack.
Plocka upp peanger, vänd på den och unclamp skiljelinjen. Slutligen Placera skålen med skiljelinjen fastsatt under mikroskop med fokus på botten av det mellersta facket. Med fett lastaren, göra en liten barriär (0,25 cm) så att när cellerna är placerad i mitten facket att de inte kan läcka ut. - Efter att ha satt upp flera kulturer, placera media DRG i varje sidofack och placera i en inkubator där cellerna kommer att bibehållas. Låt kulturerna att sitta i flera timmar och kontrollera sedan för läckage. Om materialet har läckt in i mitten facket, då kulturen är oanvändbara.
Notera: När första lära sig denna teknik är det viktigt att skapa mer kultur än vad som behövs för ett experiment, eftersom flera kommer att läckande.
Figur 3: "Good vs läckande" kultur
Att upprätthålla DRG nervceller i fackindelade kulturer
- Dag 1: Byt DRG media i sidofack med 100ng/mL DRGN media + Arac. Utför dissektion och lägga till celler till centrum fack (100.000 celler).
- Dag 2: Lägg 10ng/mL media + Arac till utsidan av teflon avdelare tills medierna flyter över fettspärr och utbyte vätska med centrum facket.
- Dag 3: Byt media i sidofack till 100ng/mL DRGN utelämna Arac och surroundljud med 10ng/mL DRGN utelämna Arac.
- Dag 6: Byt media i sidofack till 1ng/mL + Arac och surroundljud med DRG media + Arac.
- Dag 9: Använd för experiment.
Figur 4: IHC bilder av cellens organ och distala axoner
Observera: Vid byte av media, är det viktigt att aspirera vätskan från toppen av varje sida fack. Också, aldrig ändra media från det mellersta facket självt, bara från surround, och lät den rinna över fettet barriären till centrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här filmen har vi visat hur man förbereder och underhåller fackindelade kamrar för användning i nervceller odling DRG. Görs rätt, ger detta system separation av cellkroppen från axonet för att studera mekanismer genom vilka neurotrofinernas signaler över långa axoner. Eftersom det finns fluidic isolering mellan fack, gör det för selektiv stimulering eller behandling av en avdelning utan att de andra facken påverkas. Fackindelade kammare kulturer kan stödja andra celltyper inklusive sympatiska nervceller från den överlägsna livmoderhalscancer ganglierna, retinal nervceller ganglion, och kortikala nervceller. Spatial förståelse för neurotrophin signaltransduktion kan ge nya insikter i behandling av neurodegenerativa sjukdomar. Flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom, Huntingtons sjukdom och motor neuron sjukdom, är förknippade med defekter i axonal transport. Nyligen genomförda studier har använt mikroflödessystem kammare i stället för dessa fackindelade kammare. Den mikroflödessystem kamrarna 4,5 ha flera fördelar för bildanalys.
Tidigare studier har testat möjligheterna för dessa kulturer för att förhindra spridning mellan axon och cellkroppen facket 1,3,6. Detta kan lätt testas genom att lägga till låga koncentrationer av ett färgämne som trypan blå till ett fack bara, och leta efter spridning av färgen. Det ska vara liten eller ingen spridning synliga inom 24 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Katharina Cosker och Stephanie Courchesne för bra diskussioner.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen | Reagent | BD Biosciences | 354249 | |
| N2-methylcellulose 400CPS | Reagent | Sel-Win Chemicals | ||
| Teflon divider | Other | Tyler Research | CAMP10 | many other types of dividers are available |
| Pin rake | Tool | Tyler Research | Camp-PR | |
| Grease loader | Tool | Tyler Research | Camp-GLSS | |
| DMEM | Reagent | Fisher Scientific | MT10017CV | |
| NGF | Reagent | PeproTech Inc | 450-01 | |
| BDNF | Reagent | PeproTech Inc | 450-02 | |
| High vacuum grease | Reagent | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| AraC | Reagent | Sigma-Aldrich | C-1768 | |
| 23 gauge luer stub adapter | Tool | Fisher Scientific | 427565 | |
| 90° angle hemostats | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 |
References
- Campenot, R. B. Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites. Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).
- Watson, F. L., et al. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response. Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).
- Heerssen, H. M., et al. Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons. Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, 599-605 (2006).
- Park, J. W., et al. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).
- Ure, D. R., et al. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).
