整装在鸡的抗体染色方法

Summary

本视频演示了整个安装免疫组织化学，抗原的时空表达模式的方法是，可以在年轻的鸡胚可视。这种方法最初是由简多德和汤姆Jessell。

Abstract

鸡胚是一个有价值的工具，在早期胚胎发育的研究。其透明度，可获得性和易于操纵，使其研究在发育中的大脑，神经管和体节抗体表达的理想工具。本视频演示了在整个安装使用HRP标记二抗抗体染色的不同步骤，首先，从鸡蛋解剖胚胎和多聚甲醛固定。二，内源性过氧化物酶的灭活胚胎，然后暴露的主要抗体。经过多次洗涤，胚胎培养，以辣根过氧化物酶标记的第二抗体。过氧化物酶活性，发现用二氨基联苯胺底物的反应。最后，胚胎是固定的，摄影和切片处理。在使用荧光抗体这种方法的优点是可以处理的胚胎蜡切片，从而使截面抗原的网站研究。这种方法最初是由简多德和汤姆Jessell

Protocol

一，原理概述：

本视频演示了在整个装载在鸡胚免疫组织化学的不同步骤。首先，胚胎是固定在煤灰[IHC1]。然后淬火，内源性过氧化物酶的活性[IHC2]。胚胎培养中的主要抗体[IHC3]。经过多次洗涤，胚胎是在二抗孵育[IHC4];显色反应显示使用民建联[IHC5并出现抗体染色橙[IHC6]。

第1部分：固定的胚胎

1. 要执行整装免疫组织化学鸡胚，首先打开一个鸡蛋，攻壳钳和消除件的外壳。
2. 删除与钳厚白蛋白，粗钳倾斜卵黄囊使胚胎朝上。
3. 用细剪刀，切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。从蛋黄用勺子取出胚胎，并在含有PBS菜的地方。
4. 一个夹层显微镜下，小心地取出膜，蛋黄和胚胎移植到一个新的菜含有PBS。
5. 钳和昆虫引脚引脚的胚胎，并吸出PBS的。替换，与4％的PBS PFA，并让胚胎在室温下修复的上半年。

第2部分：准备胚胎抗体的一步

1. 为了尽量减少潜在的微生物污染，使用以下步骤_{DDH 2} O 。
2. 胚胎固定后，吸出固定液，并妥善处置化学废物。填写菜用PBS。
3. 下，使用显微切割刀，切一个胚胎周围的广场删除胚外膜。取出钳虫引脚。
4. 引脚已被删除后，使用钝年底巴斯德吸管胚胎转移到闪烁瓶中含有与PBT（PBS pH值7.4，0.5％TRITON X）。
5. 洗净与PBT的胚胎，3次，每次10分钟。
6. 从闪烁瓶中取出PBT和替换PBTx含有0.3％H _{2 O 2，}以灭活内源性过氧化物酶的潜在。
7. 孵育在室温下2小时就nutator。
8. PBT，3次，每次10分钟，然后3次，每次30分钟洗净的胚胎。

第3部分：抗体孵育

1. 与抗体染色胚胎，阻止缓冲区或1％BSA / 1％农工商/ PBT（我们使用，因为二级抗体山羊提出的农工商超市）的胚胎洗一小时开始。一小时在室温下孵育nutator。
2. 稀释阻塞的缓冲区，并在这2天在4 °上nutator彗星的解决方案培育胚胎的主要抗体1:1。小学抗体稀释倍数取决于初级抗体的选择。在这里，我们使用的发育研究杂交瘤细胞上清提供的银行，这是一种抗体。我们在封闭液稀释为1:1。
3. 接下来，执行3 PBT 10分钟洗涤，其次是在PBT洗涤3 1小时。
4. 洗涤后，在封闭液稀释的二级抗体1:2500（过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（H + L），孵化的胚胎，并在此解决方案在这种情况下，O / N在4 °彗星上nutator。
5. 执行3 10分钟的洗涤，在PBT 3 1小时在PBT洗涤。

第3部分：显色反应

1. 要发展的显色反应的染色胚胎，第一次执行2 Tris缓冲液（100MM三盐酸，pH值7.4）20分钟的清洗。
2. 同时民建联基板（3,3' - 二氨基tetrahydrochloride）溶解在Tris缓冲500μg/ml通风柜下，保持在黑暗的解决方案，在冰上。
3. 小瓶含胚胎取出最后的Tris缓冲液洗和步骤3.25毫升DAB溶液取代。在20分钟就nutator保持黑暗。处理的Eppendorf提示中含有10％的漂白粉溶液，以净化民建联桶。
4. 同时准备了0.3％的股票卫生署₂ H _{2 O 2}在冰上。
5. 加入50μL股票H _{2 O 2}小瓶民建联胚胎。请在黑暗。 1-2分钟后，显示器在显微镜下的反应。

第4部分：摄影和组织学胚胎处理

1. 当显色反应完成后，民建联在处置漂白水桶。更换5毫升自来水。
2. 进行10分钟的PBS洗。
3. 要处理摄影和蜡切片，脱水乙醇（25％，50％，75％和100％），每次10分钟。
4. 更换乙醇与0.5 - 1毫升雪松木油（这会令胚胎半透明）。雪松木油的摄影过程​​。
5. 摄影后，返回胚胎样品瓶和雪松木油取代100％的乙醇。重复乙醇一步。
6. 更换Ëthanol 5％快绿FCF 100％的乙醇，孵育3分钟（这一步将会使胚胎组织学可见）。替换快绿FCF解决方案100％的乙醇和组织学过程。

代表性的成果：

在下面的例子所示，胚胎阶段的HH 10（A）12（B）和11（三）在解剖胚胎显示在新兴的神经crestas百富7的表达以及在体节和神经管（A，B）; （c）中，脊索的是标有15.3B9（不- 1）（发育研究杂交瘤细胞银行提供的抗体）。

Discussion

本视频演示了年轻的鸡胚在执行整个安装抗体染色的不同步骤。这个协议基本上是用于^小鸡 2,3表征的新型抗体的空间和时间，以及已知的抗原标志物的使用，以^确定胚胎畸形，侮辱4。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Eggs		Charles River Laboratories	Premium Fertile	Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator	Other	Lyon	RX
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Tool	Fine Science Tools	11002-13
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Microdissecting knife	Tool	Fine Science Tools	10056-12	Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
30% H2O2	Reagent	Sigma-Aldrich	H1009
BSA	Reagent	Sigma-Aldrich	A3803
NGS	Reagent	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Primary Antibodies	Reagent	Developmental Studies Hybridoma Bank	4G11, 15.3B9, PAX7	For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Reagent	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	34001	Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.
Cedar wood oil	Reagent	Sigma-Aldrich	W522503
Fast green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F7252
Minuten pins 0.2mm diam		Fine Science Tools	26002-20