Summary
וידאו זה מדגים כל הר אימונוהיסטוכימיה, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של אנטיגן ניתן דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג'יין דוד וטום Jessell.
Abstract
עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, הופכים אותו לכלי אידיאלי ללימוד ביטוי הנוגדן בפיתוח, המוח צינור somite עצביים. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים מכתים כל הר נוגדנים באמצעות נוגדנים HRP משני מצומדות: ראשית, העובר גזור מן הביצה ואת קבוע paraformaldehyde. Peroxidase שנית, אנדוגני הוא מובטל, העובר חשוף ואז נוגדן ראשוני. לאחר מספר שוטף, העובר הוא מודגרות עם נוגדנים משני מצומדות כדי HRP. פעילות peroxidase מתגלה באמצעות תגובה עם המצע diaminobenzidine. לבסוף, העובר מקובע ומעובד צילום חתך. היתרון של שיטה זו על השימוש של נוגדנים ניאון היא כי עוברי יכול להיות מעובד על חתך שעווה, ובכך לאפשר לימוד של אתרי אנטיגן חתך. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג'יין דוד וטום Jessell
Protocol
I. סקירה סכמטית:
סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים אימונוהיסטוכימיה הר שלם בעובר האפרוח. ראשית, העובר הוא קבוע PFA [IHC1]. ואז, פעילות peroxidase אנדוגני הוא הרווה [IHC2]. העובר הוא מודגרות אז הנוגדן העיקרי [IHC3]. לאחר מספר שוטף, העובר הוא מודגרות ב נוגדנים משני [IHC4]; התגובה צבע מתגלה באמצעות DAB [IHC5] ו מכתים נוגדן מופיע כתום [IHC6].
חלק 1: תיקון העוברים
- כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה הר שלם על עוברי חומוס, ביצה פותח לראשונה על ידי הקשה על פגז עם מלקחיים והסרת חתיכות של הקליפה.
- הסר את אלבומין עבה עם מלקחיים, ו להטות את שק החלמון עם מלקחיים גס כל כך עובר את פניהם כלפי מעלה.
- בעזרת מספריים בסדר, לחתוך ריבוע של שק חלמון סביב העובר. מוציאים את העובר מן החלמון עם כפית, ומניחים צלחת ובה PBS.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר בזהירות את הקרומים וחלמון והעברת עובר לצלחת טרי המכיל PBS.
- הצמד את העובר למטה עם מלקחיים וסיכות חרקים, ואת לשאוב PBS. החלף את זה עם PFA 4% ב-PBS, ומאפשרים לעובר לתקן 1h ב RT.
חלק 2: עוברים הכנות לקראת השלב נוגדן
- כדי למזער את זיהום מיקרוביאלי פוטנציאל, להשתמש DDH 2 O בכל השלבים הבאים.
- לאחר העובר הוא קבוע, לשאוב את הפתרון מקבע ועושה כראוי כמו פסולת כימית. מלאו את המנה עם PBS.
- הבא, בעזרת סכין microdissection, לחתוך ריבוע סביב העובר להסיר ממברנות extraembryonic. הסר סיכות חרקים עם מלקחיים.
- לאחר סיכות הוסרו, להשתמש סוף קהה פיפטה פסטר להעביר את העובר כדי בקבוקון המכיל scintillation עם PBT (PBS pH 7.4, טריטון X 0.5%).
- לשטוף את העובר עם PBT, 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
- הסר PBT מבקבוקון הנצנץ, ולהחליף PBTx המכיל 0.3% H 2 O 2 כדי להשבית peroxidase אנדוגני פוטנציאליים.
- דגירה עבור שעה 2 ב RT על nutator.
- לשטוף עם העובר PBT, 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן 3 פעמים במשך 30 דקות כל אחד.
חלק 3: דגירה נוגדן
- כדי להכתים את העובר עם נוגדנים, להתחיל לשטוף את העובר במשך שעה אחת במאגר חסימה או 1% BSA / NGS 1% / PBT (אנו משתמשים NGS כי נוגדנים משני גדל עז). לדגור על nutator למשך שעה אחת ב RT.
- לדלל את הנוגדן העיקרי 01:01 במאגר חוסם, ואת העובר דגירה בפתרון זה עבור 2 ימים 4 ° C על nutator. הגורם העיקרי דילול נוגדן תלוי בבחירת הנוגדן הראשוני. כאן, אנו משתמשים נוגדן מן התפתחותית מחקרים Hybridoma הבנק, אשר כאמור supernatent. אנו לדלל אותה 01:01 בחסימת חיץ.
- הבא, לבצע 3 10 דקות שוטף ב PBT, ואחריו 3 1 שעות שוטף של PBT.
- לאחר כביסה, לדלל את הנוגדן 1:2500 משני חיץ חוסם (במקרה זה peroxidase מצומדות-עיזים אנטי עכבר IgG (H + L), ו העובר דגירה בפתרון זה O / N ב 4 ° C על nutator.
- בצעו 3 10 דקות שוטף ב PBT, ואחריו 3 1 שעות שוטף ב PBT.
חלק 3: תגובת צבע
- כדי לפתח את התגובה צבע של העובר מוכתם, תחילה לבצע 2 20 דקות שוטף של טריס חיץ (100mm טריס HCl, pH 7.4).
- בינתיים לפזר מצע DAB (3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride) ב טריס חוצץ ב 500μg/ml מתחת למכסה המנוע קטר; לשמור על פתרון בחושך, על הקרח.
- הסר האחרון לשטוף טריס חיץ מן העובר בקבוקון המכיל ולהחליף פתרון DAB 5 מ"ל משלב 3.2. שמור בחושך על nutator עבור 20 mn. השלך Eppendorf קצה בדלי המכיל פתרון אקונומיקה 10% על מנת לטהר DAB.
- בינתיים להכין המניה 0.3% H 2 O 2 ב DH 2 O על הקרח.
- הוסף מניות 50μl H 2 O 2 ל בקבוקון המכיל עוברים DAB. שמור בחושך. אחרי 1-2 דקות, לפקח התגובה תחת מיקרוסקופ.
חלק 4: עיבוד העובר על צילום היסטולוגיה
- כאשר התגובה צבע הושלמה, להיפטר DAB בדלי אקונומיקה. החלף עם 5 מ"ל מים מהברז.
- בצע 2 10 דקות שוטף ב PBS.
- כדי תהליך הצילום חתך שעווה, מייבשים בסדרה אתנול (25%, 50%, 75% ו 100%) במשך 10 דקות כל אחד.
- החלף את אתנול עם 0.5-1 מ"ל שמן עץ הארז (זה יהפוך את השקוף העובר). תהליך לצילום בשמן עץ ארז.
- בעקבות הצילום, לחזור אל העובר בקבוקון ולהחליף את שמן עץ ארז עם 100% אתנול. חזור על שלב אתנול.
- החלף דוארthanol עם FCF 5% ירוק מהיר ב 100% אתנול, ו דגירה במשך 3 דקות (שלב זה יגרום עוברים גלוי עבור היסטולוגיה). החלף פתרון מהיר ירוק FCF עם 100% אתנול ו תהליך היסטולוגיה.
נציג תוצאות:
בדוגמאות להלן, עוברים הם גזור בשלבים HH 10 (א), 12 (ב) ו -11 (ג); עוברים להראות ביטוי PAX 7 ב crestas עצביים המתעוררים גם somites ו בצינור העצבי (A, B); ב (ג), notochord התווית 15.3B9 (לא-1) (נוגדנים הניתנים על ידי התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בביצוע כל הר מכתים נוגדן בעוברים אפרוח צעיר. פרוטוקול זה משמש בעיקר לאפיון במרחב ובזמן של נוגדנים הרומן חומוס 2,3, כמו גם לשימושם של סמנים antigenic ידוע כדי לקבוע מומים עובריים הבאים להעליב 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
נוגדנים חד שבטיים (15.3B9, PAX7) שפותח על ידי (J. Dodd, TM Jessell וא Kawakami) התקבלו בנק Hybridoma מחקרים התפתחותיים שפותחה בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה מדעים ביולוגיים , איווה. DP הוא חתן פרס רות Kirschstein DA021977 1F32-01A1 מן המכון הלאומי האמריקני לשימוש בסמים. עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
