Summary
Este vídeo demonstra toda montagem imuno-histoquímica, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de um antígeno pode ser visualizada em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por Jane Dodd e Tom Jessell.
Abstract
O embrião de galinha é uma ferramenta valiosa no estudo do desenvolvimento embrionário precoce. Sua transparência, acessibilidade e facilidade de manipulação, torná-lo uma ferramenta ideal para estudar a expressão de anticorpos no desenvolvimento do cérebro do tubo, neural e somito. Este vídeo demonstra as diferentes etapas no todo-mount coloração anticorpos, por meio HRP conjugados anticorpos secundários; Primeiro, o embrião é dissecada do ovo e fixados em paraformaldeído. Peroxidase, segundo endógena é inativada; O embrião é, então, expostas ao anticorpo primário. Depois de várias lavagens, o embrião é incubada com anticorpo secundário conjugado com HRP. Atividade da peroxidase é revelada através de reação com o substrato diaminobenzidina. Finalmente, o embrião é fixo e processados para a fotografia e corte. A vantagem deste método sobre o uso de anticorpos fluorescentes é que os embriões podem ser processados para o seccionamento de cera, possibilitando o estudo de locais de antígeno em seção transversal. Este método foi originalmente introduzido por Jane Dodd e Jessell Tom
Protocol
I. Visão geral esquemática:
Este vídeo demonstra as diferentes etapas imunohistoquímica montar todo em embrião de galinha. Primeiro, o embrião é fixado em PFA [IHC1]. Então, a atividade da peroxidase endógena se apaga [IHC2]. O embrião é, então, incubadas em anticorpo primário [IHC3]. Depois de várias lavagens, o embrião é incubado em anticorpo secundário [IHC4]; Reação de cor é revelada usando DAB [IHC5] e coloração de anticorpos parece laranja [IHC6].
Parte 1: Corrigindo os embriões
- Para executar imunohistoquímica montagem toda em embriões de galinha, primeiro abra um ovo tocando no shell com uma pinça e retirar pedaços da casca.
- Remova a albumina espessa com uma pinça, e incline o saco vitelino com uma pinça grossa para que o embrião voltado para cima.
- Com uma tesoura fina, corte um quadrado de saco vitelino em torno do embrião. Remover o embrião da gema com uma colher e coloque em um prato contendo PBS.
- Sob um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente as membranas e gema ea transferência do embrião para um prato de doce contendo PBS.
- Pin o embrião para baixo com uma pinça e pinos de insetos, e aspire a PBS. Substituir isto por PFA 4% em PBS, e permitir que o embrião se fixar 1h em temperatura ambiente.
Parte 2: embriões Preparando-se para a etapa de anticorpos
- Para minimizar a contaminação microbiana potencial, use DDH 2 O em todos os passos seguintes.
- Depois que o embrião é fixo, aspire a solução fixadora e descartar adequadamente os resíduos químicos. Encha o prato com PBS.
- em seguida, usando uma faca de microdissecção, corte um quadrado em torno do embrião para remover membranas extra-embrionário. Remova os pinos de inseto com uma pinça.
- Depois dos pinos terem sido removidos, usar um blunt end Pasteur pipeta para transferir o embrião para um frasco de cintilação contendo com PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
- Lave o embrião com PBT, 3 vezes por 10 minutos cada.
- Remover PBT do frasco de cintilação, e substituir com PBTx contendo 0,3% de H 2 O 2, a fim de inativar peroxidase endógena potencial.
- Incubar por 2 horas em temperatura ambiente em nutator.
- Lavar embrião com PBT, 3 vezes por 10 minutos cada, em seguida, 3 vezes por 30 minutos cada.
Parte 3: a incubação de anticorpos
- Para manchar o embrião com anticorpo, comece por lavar o embrião de uma hora em tampão de bloqueio ou 1% BSA / NGS 1% / PBT (usamos NGS porque o anticorpo secundário é gerado em cabra). Incubar no nutator durante uma hora a RT.
- Diluir o anticorpo primário 1:1 em tampão de bloqueio, e embrião incubar nesta solução por 2 dias a 4 ° C em nutator. Fator de diluição primária de anticorpos depende da escolha do anticorpo primário. Aqui, usamos um anticorpo do Desenvolvimento Estudos Hibridoma Bank, que é fornecido como sobrenadante. Nós diluir 1:1 em tampão de bloqueio.
- Em seguida, realizar 3 lavagens de 10 minutos em PBT, seguido por 3 lavagens de 1 hora em PBT.
- Após a lavagem, diluir o anticorpo secundário 1:2.500 em tampão de bloqueio (neste caso cabra conjugado peroxidase-anti-rato IgG (H + L), e embrião incubar nesta solução S / N, 4 ° C em nutator.
- Realizar 3 lavagens de 10 minutos em PBT, seguido por 3 lavagens de 1 hora em PBT.
Parte 3: Reação de cor
- Para desenvolver a reação de cor do embrião manchada, primeiro realizar duas lavagens de 20 minutos em tampão Tris (100mM Tris HCl, pH 7,4).
- Enquanto isso, dissolver substrato DAB (3,3 tetrahidrocloreto 'diaminobenzidina) em tampão Tris em 500μg/ml sob capela; manter solução no escuro, sobre o gelo.
- Remover o tampão de lavagem última Tris do embrião frasco contendo solução e substituir com DAB 5ml a partir do passo 3.2. Manter no escuro sobre nutator por 20 mn. Dispor de Eppendorf ponta em balde contendo uma solução de lixívia a 10%, a fim de descontaminar DAB.
- Enquanto isso, prepare um estoque de 0,3% H 2 O 2 em dH 2 O no gelo.
- Adicionar 50μl de ações H 2 O 2 para o frasco contendo embriões em DAB. Manter-se na escuridão. Depois de 1-2 minutos, monitor reação sob microscópio.
Parte 4: processamento de embriões para a fotografia e histologia
- Quando a reação de cor é completa, dispor de DAB em balde de lixívia. Substitua a água da torneira com 5 ml.
- Executar duas lavagens de 10 minutos em PBS.
- Ao processo para a fotografia e secção de cera, desidratar em série etanólica (25%, 50%, 75% e 100%) por 10 minutos cada.
- Substituir o etanol, com 0,5 - 1 ml de óleo de cedro madeira (isto fará com que o embrião translúcido). Processo para a fotografia em cedro óleo de madeira.
- Após a fotografia, o retorno do embrião para o frasco e substituir o óleo de madeira de cedro com etanol 100%. Repita o passo etanol.
- Substituir ethanol com 5% FCF verde rápido em etanol 100% e incubar por 3 minutos (este passo fará embriões visível para histologia). Substituir rápido FCF solução verde com 100% de etanol e processo para histologia.
Resultados representativos:
Nos exemplos abaixo, os embriões são dissecados em estágios HH 10 (A), 12 (B) e 11 (C); embriões mostram expressão de PAX 7 em emergentes crestas neural bem como em somitos e tubo neural (A, B); Em (C), notocorda é rotulado com 15.3B9 (Não-1) (anticorpos fornecidos pelo Banco de Desenvolvimento de Estudos Hibridoma).
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Discussion
Este vídeo demonstra as diferentes etapas na realização de todo-mount coloração de anticorpos em embriões de galinha jovens. Este protocolo é essencialmente utilizado para a caracterização espacial e temporal de anticorpos romance em pinto 2,3, bem como para o uso de marcadores antigênicos conhecidos para determinar malformações embrionárias seguintes insulto 4.
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Acknowledgments
Os anticorpos monoclonais (15.3B9, Pax7), desenvolvido por (J. Dodd, TM Jessell e A. Kawakami) foram obtidos do Banco de Desenvolvimento Hibridoma Estudos desenvolvidos sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas , Iowa. DP é destinatário de Ruth Award Kirschstein DA021977 1F32-01A1 do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas. Este trabalho foi financiado pela M. Margaret Alkek Fundação RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
