Summary
Cette vidéo montre tout le mont immunohistochimie, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle d'un antigène peut être visualisé dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par Jane et Tom Dodd Jessell.
Abstract
L'embryon de poulet est un outil précieux dans l'étude du développement embryonnaire précoce. Sa transparence, l'accessibilité et la facilité de manipulation, en font un outil idéal pour étudier l'expression d'anticorps dans le développement du cerveau, du tube neural et des somites. Cette vidéo montre les différentes étapes de coloration des anticorps entiers de montage en utilisant HRP conjugué anticorps secondaire; d'abord, l'embryon est disséquée de l'oeuf et fixés dans du paraformaldéhyde. Deuxièmement, la peroxydase endogène est inactivé; L'embryon est ensuite exposée à l'anticorps primaire. Après plusieurs lavages, l'embryon est incubée avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP. L'activité peroxydase est révélée en utilisant la réaction avec le substrat diaminobenzidine. Enfin, l'embryon est fixe et traitées pour la photographie et de sectionnement. L'avantage de cette méthode sur l'utilisation d'anticorps fluorescents est que les embryons peuvent être traités pour la coupe de la cire, permettant ainsi à l'étude de sites antigéniques en coupe transversale. Cette méthode a été initialement présenté par Jane et Tom Dodd Jessell
Protocol
I. Schéma Aperçu:
Cette vidéo montre les différentes étapes de l'immunohistochimie monter ensemble dans l'embryon de poulet. Tout d'abord, l'embryon est fixé en PFA [IHC1]. Ensuite, l'activité peroxydase endogène est éteint [IHC2]. L'embryon est ensuite incubée dans l'anticorps primaire [IHC3]. Après plusieurs lavages, l'embryon est incubé dans anticorps secondaire [IHC4]; réaction colorée se révèle en DAB [IHC5] et la coloration des anticorps apparaît orange [IHC6].
Partie 1: Fixation des embryons
- Pour effectuer immunohistochimie monter ensemble sur les embryons de poulet, d'abord ouvrir un oeuf en tapant la coquille avec une pince et enlever des morceaux de la coquille.
- Retirez l'albumine épaisse avec une pince, et de l'inclinaison du sac vitellin avec des pinces grossières pour que l'embryon tournée vers le haut.
- Avec des ciseaux fins, découpez un carré de vitellus autour de l'embryon. Retirez l'embryon du jaune avec une cuillère, et les placer dans un plat contenant du PBS.
- Sous un microscope de dissection, retirer soigneusement les membranes et le jaune et le transfert d'embryon dans un plat frais contenant du PBS.
- Pin de l'embryon vers le bas avec des pinces et des épingles d'insectes, et aspirer le PBS. Remplacez cela avec 4% en PBS PFA, et permettent de fixer l'embryon 1h à température ambiante.
Partie 2: Préparation des embryons pour l'étape d'anticorps
- Pour minimiser la contamination microbienne potentielle, utilisez ddH 2 O dans toutes les étapes suivantes.
- Après l'embryon est fixe, aspirer la solution fixateur et éliminer correctement les déchets chimiques. Remplir le plat avec du PBS.
- Ensuite, en utilisant un couteau de microdissection, couper un carré autour de l'embryon pour enlever les membranes extra-embryonnaires. Retirer les épingles insectes avec une pince.
- Après les broches ont été enlevées, utiliser une pipette Pasteur émoussée fin de transférer l'embryon d'un flacon à scintillation contenant des PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
- Laver l'embryon avec PBT, 3 fois pendant 10 minutes chacun.
- Retirer PBT du flacon à scintillation, et la remplacer par PbTx contenant 0,3% de H 2 O 2 afin d'inactiver peroxydase endogène potentiel.
- Incuber pendant 2 heures à température ambiante sur les nutator.
- Lavez embryon avec PBT, 3 fois pendant 10 minutes chacun, puis 3 fois pendant 30 minutes chacun.
Partie 3: l'incubation d'anticorps
- Tacher l'embryon avec l'anticorps, commencez par laver l'embryon pendant une heure dans un tampon de blocage ou de 1% de BSA / END 1% / PBT (nous utilisons NGS parce que les anticorps secondaire est soulevée dans de chèvre). Incuber sur nutator pendant une heure à température ambiante.
- Diluer l'anticorps primaire 1:01 dans un tampon de blocage, et l'embryon incuber dans cette solution pendant 2 jours à 4 ° C sur nutator. Primaire facteur de dilution d'anticorps dépend du choix de l'anticorps primaire. Ici, nous utilisons un anticorps de la Banque de développement d'études d'hybridome, qui est fourni surnageant. Nous diluer 1:1 dans un tampon bloquant.
- Ensuite, effectuez trois de 10 minutes lavages en PBT, suivis de 3 en 1 heure lavages en PBT.
- Après le lavage, diluer l'anticorps secondaire 1:2500 dans le tampon de blocage (dans ce cas, conjuguée à la peroxydase-chèvre anti-souris IgG (H + L), et de l'embryon incuber dans cette solution S / N à 4 ° C sur nutator.
- Effectuer 3 10 minutes lavages en PBT, suivis de 3 en 1 heure lavages en PBT.
Partie 3: réaction colorée
- Pour la réaction de couleur de l'embryon taché, d'abord effectuer deux lavages de 20 minutes dans du tampon Tris (Tris HCl 100 mM, pH 7,4).
- En attendant la dissolution du substrat DAB (3,3 '-diaminobenzidine tétrachlorhydrate) dans un tampon Tris à 500μg/ml sous une hotte; garder solution dans l'obscurité, sur la glace.
- Enlever le dernier tampon de lavage Tris partir de l'embryon flacon contenant et remplacer avec une solution DAB 5ml de l'étape 3.2. Gardez à l'sombres sur nutator pendant 20 mn. Eliminer Eppendorf pointe dans un seau contenant une solution javellisée à 10% pour décontaminer DAB.
- Pendant ce temps préparer un stock de 0,3% H 2 O 2 en DH 2 O sur la glace.
- Ajouter le bouillon de 50 pl H 2 O 2 à fiole contenant des embryons en DAB. Gardez à l'obscurité. Après 1-2 minutes, surveiller la réaction sous le microscope.
Partie 4: le traitement des embryons pour la photographie et de l'histologie
- Lorsque la réaction colorée est complet, jetez-DAB dans un seau l'eau de Javel. Remplacez-le par 5 ml d'eau du robinet.
- Effectuer deux 10 minutes lavages en PBS.
- Pour traiter de la photographie et le sectionnement de la cire, déshydrater dans une série d'éthanol (25%, 50%, 75% et 100%) pendant 10 minutes chacun.
- Remplacer l'éthanol avec 0,5 - 1 ml d'huile de bois de cèdre (cela va rendre le translucides embryon). Processus pour la photographie dans l'huile de bois de cèdre.
- Après la photographie, le retour d'embryons pour flacon et remplacer l'huile de bois de cèdre avec de l'éthanol à 100%. Répétez l'étape d'éthanol.
- Remplacer ethanol avec 5% vert solide FCF rapide dans de l'éthanol à 100%, et incuber pendant 3 minutes (cette étape fera embryons visibles pour l'histologie). Remplacer Rapide solution verte FCF avec de l'éthanol 100% et un processus pour l'histologie.
Les résultats représentatifs:
Dans les exemples ci-dessous, les embryons sont disséqués à des stades HH 10 (A), 12 (B) et 11 (C), les embryons montrent une expression de la PAX 7 dans les pays émergents Crestas neurones ainsi que dans les somites et le tube neural (A, B); En (C), la notochorde est étiqueté avec 15.3B9 (Pas-1) (anticorps fournis par la Banque de développement d'études d'hybridome).
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Discussion
Cette vidéo montre les différentes étapes dans l'exécution de coloration des anticorps entiers monter dans des embryons de poulet jeunes. Ce protocole est essentiellement utilisé pour la caractérisation spatiale et temporelle de nouveaux anticorps chez le poulet 2,3, ainsi que pour l'utilisation de marqueurs antigéniques connues pour déterminer les malformations embryonnaires suivantes insulte 4.
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Acknowledgments
Les anticorps monoclonaux (15.3B9, PAX7) développé par (J. Dodd, MC Jessell et A. Kawakami) ont été obtenus auprès de la Banque de développement d'hybridomes études élaborées sous les auspices de l'NICHD et maintenu par l'Université de l'Iowa, Département des sciences biologiques , dans l'Iowa. DP est récipiendaire du Prix Ruth Kirschstein 1F32-01A1 DA021977 du National Institute on Drug Abuse. Ce travail a été soutenu par la Fondation Margaret M. Alkek au RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
