Summary
Questo video dimostra tutta montare immunoistochimica, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale di un antigene può essere visualizzata in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell.
Abstract
L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare l'espressione di anticorpi nello sviluppo del cervello, del tubo neurale e somite. Questo video mostra le diverse fasi, in tutto il montaggio colorazione anticorpale utilizzando anticorpi coniugati con HRP secondaria; In primo luogo, l'embrione è sezionato dall'uovo e fissati in paraformaldeide. In secondo luogo, perossidasi endogena è inattivato; L'embrione viene quindi esposto a anticorpo primario. Dopo numerosi lavaggi, l'embrione viene incubato con l'anticorpo secondario coniugato con HRP. Perossidasi viene rivelato tramite la reazione con il substrato diaminobenzidina. Infine, l'embrione è fisso ed elaborati per la fotografia e sezionamento. Il vantaggio di questo metodo rispetto all'uso di anticorpi fluorescenti è che gli embrioni possono essere trattati per sezionamento cera, permettendo così lo studio dei siti antigene nella sezione trasversale. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell
Protocol
I. Panoramica schematica:
Questo video mostra le diverse fasi in immunoistochimica montare tutto in embrione di pollo. In primo luogo, l'embrione è fissato in PFA [IHC1]. Poi, l'attività della perossidasi endogena si spegne [IHC2]. L'embrione viene quindi incubato in anticorpo primario [IHC3]. Dopo numerosi lavaggi, l'embrione viene incubato in anticorpo secondario [IHC4]; reazione del colore è rivelato utilizzando DAB [IHC5] e colorazione anticorpale sembra arancione [IHC6].
Parte 1: fissaggio degli embrioni
- Per eseguire immunoistochimica intero montare su embrioni di pollo, per prima cosa aprire un uovo toccando il guscio con una pinza e rimuovere i pezzi del guscio.
- Rimuovere l'albumina spessore con una pinza, e inclinare il sacco vitellino con una pinza grossolana in modo che l'embrione verso l'alto.
- Utilizzando forbici, tagliare un quadrato di tutto il sacco vitellino dell'embrione. Rimuovere l'embrione dal tuorlo con un cucchiaio, e mettere in un piatto contenente PBS.
- Sotto un microscopio dissezione, rimuovere con attenzione le membrane e il tuorlo e il trasferimento degli embrioni per un piatto fresco contenente PBS.
- Perno l'embrione giù con una pinza e perni di insetti, e aspirare il PBS. Sostituirlo con PFA 4% in PBS, e consentire l'embrione di fissare 1 ora a temperatura ambiente.
Parte 2: Preparazione di embrioni per la fase di anticorpi
- Per ridurre al minimo potenziale contaminazione microbica, utilizzare DDH 2 O in tutti i passaggi successivi.
- Dopo che l'embrione è fisso, aspirare la soluzione di fissativo e smaltire come rifiuto chimico. Riempire il piatto con PBS.
- prossimo, con un coltello microdissezione, tagliare un quadrato attorno embrione per rimuovere membrane extraembrionali. Rimuovere le spine di insetti con una pinza.
- Dopo i perni sono stati rimossi, utilizzare una pipetta Pasteur smussato fine di trasferire l'embrione in una fiala contenente scintillazione con PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
- Lavare l'embrione con PBT, 3 volte per 10 minuti ciascuno.
- Rimuovere PBT dal flaconcino scintillazione, e sostituirlo con PBTx contenenti 0,3% di H 2 O 2 al fine di inattivare perossidasi potenziale endogeno.
- Incubare per 2 ore a temperatura ambiente su nutator.
- Lavare embrione con PBT, 3 volte per 10 minuti ciascuno, poi 3 volte per 30 minuti ciascuno.
Parte 3: incubazione anticorpi
- Per colorare l'embrione con l'anticorpo, inizia lavando l'embrione per un'ora in tampone di bloccaggio o 1% BSA / 1% NGS / PBT (usiamo NGS perché l'anticorpo secondario è sollevata in capra). Incubare su nutator per un'ora a temperatura ambiente.
- Diluire l'anticorpo primario 1:1 in tampone di bloccaggio, e incubare embrione in questa soluzione per 2 giorni a 4 ° C il nutator. Primario fattore di diluizione degli anticorpi dipende dalla scelta di anticorpo primario. Qui, usiamo un anticorpo dal Developmental Studies Ibridoma Banca, che viene fornito come supernatent. Noi diluirlo 1:1 in tampone di bloccaggio.
- successiva, eseguire 3 10 minuti lava in PBT, seguita da 3 1-ora lavaggi in PBT.
- Dopo il lavaggio, diluire l'anticorpo secondario 1:2500 in tampone di bloccaggio (in questo caso coniugato perossidasi-capra anti-topo IgG (H + L), embrione e incubare in questa soluzione O / N a 4 ° C su nutator.
- Eseguire 3 10 minuti di lavaggi in PBT, seguita da 3 1-ora lavaggi in PBT.
Parte 3: reazione del colore
- Per sviluppare la reazione colore dell'embrione macchiato, prima eseguire 2 20 minuti di lavaggi in tampone Tris (100mM Tris HCl, pH 7,4).
- Nel frattempo sciogliere substrato DAB (3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro) nel tampone Tris a 500μg/ml sotto cappa aspirante; tenere soluzione nel buio, sul ghiaccio.
- Rimuovere ultimi tampone di lavaggio Tris dall'embrione fiala contenente e sostituirlo con la soluzione DAB 5ml dal punto 3.2. Tenere in scuro su nutator per 20 mn. Smaltire Eppendorf punta nel secchio contenente una soluzione di candeggina al 10% per decontaminare DAB.
- Nel frattempo preparare uno stock 0,3% H 2 O 2 in dh 2 O sul ghiaccio.
- Aggiungere il brodo di 50μl H 2 O 2 al flacone contenente gli embrioni in DAB. Tenere al buio. Dopo 1-2 minuti, monitorare la reazione al microscopio.
Parte 4: embrioni per la fotografia e istologia
- Quando la reazione del colore è completa, smaltire DAB in secchio di candeggina. Sostituire con 5 ml di acqua del rubinetto.
- Eseguire 2 10 minuti di lavaggi in PBS.
- Al processo per la fotografia e sezionamento cera, disidratano in una serie di etanolo (25%, 50%, 75% e 100%) per 10 minuti ciascuno.
- Sostituire l'etanolo da 0,5 - 1 ml di olio di cedro legno (questo renderà il traslucido embrione). Processo per la fotografia in olio di legno di cedro.
- A seguito di fotografia, di ritorno embrione a fiala e sostituire l'olio di legno di cedro con il 100% di etanolo. Ripetere il punto etanolo.
- Sostituire ethanol con il 5% FCF veloce verde in 100% etanolo, e incubare per 3 minuti (questo passo renderà visibili gli embrioni per istologia). Sostituire rapida soluzione verde FCF con il 100% di etanolo e di processo per l'esame istologico.
Rappresentante dei risultati:
Negli esempi mostrati di seguito, gli embrioni vengono sezionati in fasi HH 10 (A), 12 (B) e 11 (C); Embrioni mostrano espressione di PAX 7 in emergenti Crestas neurali così come in somiti e del tubo neurale (A, B); In (C), notocorda è etichettato con 15.3B9 (Non-1) (Anticorpi fornite dal Developmental Studies Ibridoma Bank).
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Discussion
Questo video mostra le varie fasi di esecuzione di tutto il montaggio colorazione anticorpi in embrioni di pollo giovani. Questo protocollo è essenzialmente utilizzato per la caratterizzazione spaziale e temporale di anticorpi romanzo in pulcino 2,3, così come per l'uso di marcatori antigenica nota per determinare malformazioni embrionali seguenti insulto 4.
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Acknowledgments
Gli anticorpi monoclonali (15.3B9, PAX7) sviluppato da (J. Dodd, TM Jessell e A. Kawakami) sono stati ottenuti dalla Banca dello Sviluppo Studi Ibridoma sviluppato sotto l'egida del NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Scienze biologiche , Iowa. DP è destinatario del Premio Ruth Kirschstein DA021977 1F32-01A1 dal National Institute on Drug Abuse. Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).