Summary
이 동영상은 모든 마운트 immunohistochemistry, 항원의 공간 및 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 태아의 시각 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다.
Abstract
여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브 및 체절 개발에 항체 표현을 공부를위한 이상적인 도구가합니다. 이 동영상은 HRP 복합 이차 항체를 사용하여 전체 마운트 항체 얼룩의 여러 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 내생 퍼옥시데이즈은 inactivated이며 배 (胚)는 다음 주 항체에 노출됩니다. 여러 세척 후, 배아는 HRP에 복합 보조 항체와 incubated입니다. 퍼옥시데이즈 활동 diaminobenzidine 기판과 반응을 사용하여 드러났습니다. 마지막으로, 배 (胚)는 고정하고 사진과 sectioning에 대한 처리됩니다. 형광 항체의 사용을 통해이 방법의 장점은 그 배아가 있으므로 단면의 항원 사이트의 연구를 지원, 왁스 sectioning에 대해 처리할 수 있습니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다
Protocol
I. 도식 개요 :
이 비디오는 여자의 배아에서 전체 마운트 immunohistochemistry의 여러 단계를 보여줍니다. 첫째, 배아는 PFA에서 수정된 [IHC1]. 그런 다음, 내생 퍼옥시데이즈 활동은 침묵이다 [IHC2]. 배아는 다음 주 항체 [IHC3]에서 incubated입니다. 여러 세척 후 배아가 이차 항체에 incubated입니다 [IHC4]; 컬러 반응이 DAB [IHC5]를 사용하고 계시이며 항체 얼룩이 나타납니다 오렌지 [IHC6].
1 부 : 배아를 고정
- 여자의 배아에 대한 전체 마운트 immunohistochemistry를 수행하려면 먼저 집게로 껍질을 감청하고 껍질 조각을 제거하여 계란을 엽니다.
- 포셉와 두꺼운 알부민을 제거하고, 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉로 난황을 기울.
- 좋은 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. 숟가락으로 노른자에서 배아를 제거하고, PBS를 포함하는 접시에 장소.
- 해부 현미경에서 신중하게 안정과 노른자와 PBS를 포함하는 신선한 요리로 배아 전송을 제거합니다.
- 포셉 및 곤충 핀으로 배아를 핀, 그리고 PBS를 대기음. PBS에서 4퍼센트 PFA이로 교체하고, 배아는 RT에 1H를 해결하실 수 있습니다.
2 부 : 항체 단계에 대비하여 배아
- 잠재적인 미생물 오염을 최소화하려면, 다음 단계에서 모든 ddH 2 O를 사용합니다.
- 배아가 수정되면 고정력있는 솔루션을 대기음 화학 폐기물을 적절히 처리. PBS로 요리를 입력합니다.
- 다음, microdissection 나이프를 사용하여 extraembryonic 세포막을 제거하는 배아 주위에 사각형을 했네요. 포셉과 곤충 핀을 제거합니다.
- 핀이 제거된 후, PBT (PBS 산도 7.4, 0.5 % 트리톤 X)를 포함하는 섬광의 약병에 배아를 전송하기 위해 뭉툭한 끝 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
- 십분 각, PBT 3 번 배아를 씻으십시오.
- 섬광의 병을에서 PBT를 제거하고, PBTx 잠재 내생 퍼옥시데이즈를 inactivate하기 위해 0.3 % H 2 O 2를 포함하는로 바꿉니다.
- nutator에 RT에서 2 시간을위한 부화.
- 다음 PBT 10 분 각 3 회 30 분 각 3 회와 배아를 씻으십시오.
파트 3 : 항체 인큐베이션
- 항체와 배아를 얼룩이, 차단 버퍼 또는 1% BSA / 1 % NGS / PBT (보조 항체가 염소에서 제기되기 때문에 우리가 NGS 사용) 한 시간 동안 배아를 세척하여 시작합니다. RT 한 시간 동안 nutator에 품어.
- 4 이일 ° C nutator에이 솔루션에서 차단 버퍼 및 부화 배 (胚)의 기본 항체 1시 1분을 희석. 차 항체 희석 요소는 기본 항체의 선택에 따라 달라집니다. 여기서 우리는 supernatent대로 제시됩니다 발달 연구 브리 도마 은행에서 항체를 사용합니다. 우리는 버퍼를 차단에서 1시 1분을 희석.
- 다음, PBT 3 1 시간 세척 다음 PBT 3 10 분 세척을 수행합니다.
- 세척 후, 차단 버퍼에 보조 항체를 1:2500 희석 (이 경우 퍼옥시데이즈 복합 - 염소 항 마우스 IgG (H + L),이 솔루션에 품어 배아에서 4 O / N ° nutator에 C.
- PBT 3 1 시간 세척 다음 PBT 3 10 분 세척을 수행합니다.
제 3 부 : 색상 반응
- 스테인드 배아의 색상 반응을 개발하려면 먼저 트리스 버퍼 (100mM 트리스 HCL, 산도 7.4) 2 20 분 세척을 수행합니다.
- 한편 펌 후드 아래에 500μg/ml의 트리스 버퍼에 DAB의 기판 (3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride) 디졸브, 어둠 속에서 솔루션을 유지, 얼음.
- 병을 포함 배아에서 마지막 트리스 버퍼를 제거하고 세척 단계를 3.2에서 5ml DAB 솔루션으로 대체합니다. 20 MN에 대한 nutator에 어둠 속에 보관. DAB를 오염을 제거하다하기 위해 10 % 표백 용액이 들어있는 양동이에 Eppendorf 끝 처리.
- 한편 0.3 %의 주식 얼음 DH 2 O에서 H 2 O 2를 준비합니다.
- DAB의 배아를 포함 유리병에 50μl 재고 H 2 O 2를 추가합니다. 어둠 속에 보관. 1~2분 후, 현미경으로 반응을 모니터링합니다.
4 부 : 사진 및 조직학에 대한 엠브료 처리
- 색상 반응이 완료되면, 표백 양동이에 DAB 처분. 5 ML의 수돗물로 대체합니다.
- PBS 2 10 분 세척을 수행합니다.
- 사진 및 왁스 sectioning에 대한 처리하기 위해 10 분 각각에 대해 (25 %, 50 %, 75 % 및 100 %) 에탄올 시리즈 탈수.
- 1 ML 시더 우드 오일 (이것은 배아 반투명하겠습니다) - 0.5와 에탄올을 대체합니다. 삼목 나무 기름의 사진을위한 과정입니다.
- 사진 다음, 유리병에 배아를 반환하고 100 % 에탄올로 삼목 나무 오일을 교체하십시오. 에탄올 단계를 반복합니다.
- E를 교체100 % 에탄올에 5% 빠른 그린 FCF와 thanol, 3 분 (이 단계는 조직학에 대한 배아 볼 것입니다)에 품어. 조직학에 대한 100 %의 에탄올과 프로세스 빠른 그린 FCF 솔루션을 교체합니다.
대표 결과 :
아래의 예제에서, 배아는 단계 HH 10 (A), 12 (B), 11 (C)에서 해부되며 태아는 몸의 신경 crestas에 PAX 7 표현을 보여주뿐만 아니라 somites과 신경 튜브 (A, B)에; 년 (C), notochord가 15.3B9합니다 (- 1) (발달 연구 브리 도마 은행에서 제공하는 항체)에 표시됩니다.
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Discussion
이 동영상은 젊은 여자는 배아의 전체 마운트 항체 얼룩을 수행하는 다른 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 기본적으로 여자가 2,3의 소설 항체의 공간 및 시간적 특성을 위해 사용뿐만 아니라 모욕 4 다음 배아 기형을 결정하는 것으로 알려진 antigenic 마커의 사용입니다.
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Acknowledgments
(J. 다드, TM Jessell 및 A. 가와 카미)에 의해 개발된 단클론 항체는 (15.3B9, PAX7) 생물 과학학과, 아이오와 대학에서 NICHD 유지의 후원하에 개발된 발달 연구 브리 도마 은행에서 얻은되었습니다 아이오와. DP는 약물 남용에있는 국립 연구소에서 루스 Kirschstein 수상 1F32 - 01A1 DA021977의받는 사람입니다. 이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
