Summary
Это видео демонстрирует весь горе иммуногистохимии, метод, которым пространственной и временной экспрессии антигена могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell.
Abstract
Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для исследования антител выражение в развитии мозга, нервной трубки и сомитов. Это видео демонстрирует различные этапы в целом монтажа антител окрашивания использования HRP сопряженных вторичными антителами; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эндогенной пероксидазы инактивированная; эмбрион затем подвергаются первичного антитела. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали с вторичными антителами конъюгированных с ПХ. Пероксидазы активность обнаруживаются с помощью реакции с диаминобензидина подложки. Наконец, зародыш фиксируется и обрабатывается для фотографирования и секционирования. Преимущество этого метода по сравнению с использованием флуоресцентных антител является то, что эмбрионы могут быть обработаны для воска секционирования, что позволяет изучать антигена сайтов в поперечном сечении. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell
Protocol
I. Схема Обзор:
Это видео демонстрирует различные этапы в целом иммуногистохимии монтирования в куриных эмбрионах. Во-первых, эмбрион закрепляется в PFA [IHC1]. Затем, эндогенной активности пероксидазы гасится [IHC2]. Эмбрион затем инкубировали в первичных антител [IHC3]. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали в вторичными антителами [IHC4]; Цветная реакция проявляется использования DAB [IHC5] и антитела окрашивания цвет на оранжевый [IHC6].
Часть 1: Крепление эмбрионов
- Для выполнения целого иммуногистохимии крепление на куриных эмбрионах, сначала откройте яйца, нажав оболочки с пинцетом и удаление части корпуса.
- Удалить толстые альбумина с щипцами, и наклон желточного мешка с грубыми щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
- Использование тонких ножниц, вырезать квадратный желточного мешка вокруг эмбриона. Удалить из эмбриона желток с ложкой, и место в блюдо с PBS.
- Под микроскопом рассечение, осторожно удалите мембраны и желток и перенос эмбрионов в свежем блюдо с PBS.
- Pin эмбриона вниз щипцами и насекомых булавками, и аспирата PBS. Замените это с 4% PFA в ФБР, и позволить эмбриону исправить 1 час при комнатной температуре.
Часть 2: Подготовка эмбрионы на наличие антител шаг
- Чтобы свести к минимуму возможное загрязнение микробов, использования DDH 2 O во всех следующих шагов.
- После эмбриона фиксировано, аспирация фиксирующий раствор и распоряжаться надлежащим образом как химические отходы. Заполните блюдо с PBS.
- Далее, используя микродиссекции ножом, вырезать квадрат вокруг эмбриона, чтобы удалить экстраэмбриональных мембран. Удалить насекомых булавками с щипцами.
- После контакты были удалены, используйте тупым концом пипетки Пастера перенести эмбрион сцинтилляционный флакон с PBT (PBS рН 7,4, 0,5% Triton X).
- Вымойте эмбриона с PBT, 3 раза в течение 10 минут каждый.
- Удалить из PBT сцинтилляционный флакон, и заменить PBTx, содержащие 0,3% H 2 O 2, чтобы инактивировать потенциал эндогенной пероксидазы.
- Инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре на nutator.
- Вымойте эмбриона с PBT, 3 раза по 10 минут каждый, а затем 3 раза по 30 минут каждый.
Часть 3: Антитела инкубации
- Для окраски эмбриона с антителами, начните с стиральной эмбрионов в течение одного часа в блокирующем буфере или 1% BSA / 1% NGS / PBT (мы используем NGS потому вторичными антителами возникает в козла). Инкубировать на nutator в течение одного часа при комнатной температуре.
- Развести первичного антитела 1:1 в блокирующий буфер, и инкубировать эмбриона в этом растворе в течение 2 дней при температуре 4 ° С на nutator. Первичный фактор разведения антител зависит от выбора первичного антитела. Здесь мы используем антитела из Развития Исследований Гибридома банка, который предоставляется в качестве supernatent. Мы разбавить его 1:1 в блокирующем буфере.
- Следующая, выполнять три 10-минутные моется в PBT, а затем 3 1-час моется в PBT.
- После мытья, разбавленных вторичных антител 1:2500 в блокирующем буфере (в данном случае пероксидазы сопряженным-антимышиного IgG (H + L) и инкубировать эмбриона в этом растворе O / N при температуре 4 ° С на nutator.
- Выполните три 10-минутные моется в PBT, а затем 3 1-час моется в PBT.
Часть 3: Цветная реакция
- Разработать цвет реакция окрашенных эмбриона, сначала выполнить две 20-минутные моется в трис-буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4).
- Тем временем растворяются DAB субстрата (3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride) в трис-буфере на 500μg/ml под вытяжным шкафом; держать раствор в темноте, на льду.
- Удаление последнего буфера Трис вымыть из флакона эмбриона и заменить 5 мл раствор DAB с шагом 3.2. Хранить в темном на nutator на 20 млн. Утилизировать Эппендорф чаевые в емкость, содержащую 10% гипохлоритом натрия для того, чтобы обеззараживать DAB.
- Тем временем подготовить 0,3% акций H 2 O 2 в дН 2 O на льду.
- Добавить 50 мкл акции H 2 O 2 на флакон, содержащий эмбрионов в DAB. Имейте в темноте. Через 1-2 минут, контролировать реакции под микроскопом.
Часть 4: Эмбрион обработки фотографий и гистологии
- Когда цветная реакция завершена, распоряжаться DAB в отбеливатель ведро. Заменить на 5 мл водопроводной воды.
- Выполните 2 10-минуте моется в PBS.
- Для обработки для фотографии и воска секционирования, обезвоживаются в серии этанола (25%, 50%, 75% и 100%) в течение 10 минут каждый.
- Замените этанола с 0,5 - 1 мл масла кедрового дерева (это сделает эмбриона полупрозрачные). Процесс фотографии в масле кедрового дерева.
- После фотографии, вернуть эмбрион флакон и заменить масло кедрового дерева со 100% этанола. Повторите этанола шаг.
- Замените электроннойthanol с 5% Быстрый зеленый FCF в 100% этанола, и инкубировать в течение 3 минут (этот шаг сделает эмбрионов видимым для гистологии). Замените Быстрый зеленый раствор FCF со 100% этанола и процесс гистологии.
Представитель Результаты:
В примерах, приведенных ниже, эмбрионы расчлененный на этапах HH 10 (А), 12 (Б) и 11 (С); Эмбрионы показать выражение PAX 7 на развивающихся нейронных crestas также в сомитов и нервной трубки (А, В); В (С), хорда помечена 15.3B9 (Не-1) (Антитела предоставляемые развитием исследований Гибридома банк).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это видео демонстрирует различные этапы в выполнении целого монтажа антител окрашивания у молодых куриных эмбрионов. Этот протокол существенно используется пространственная и временная характеристика новых антител в куриных 2,3, а также для использования известных маркеров для определения антигенных эмбриональных пороков следующие оскорбления 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Моноклональных антител (15.3B9, Pax7), разработанная (Дж. Додд, ТМ Jessell и А. Каваками) были получены из исследований развитием Гибридома Банке разработана под эгидой NICHD и поддерживается университете штата Айова, Отделение биологических наук , штат Айова. DP является получателем Рут Kirschstein премии 1F32-01A1 DA021977 из Национального института по злоупотреблению наркотиками. Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
